[发明专利]一种适于PCR扩增的燕麦种子DNA大量提取及纯化方法

权利要求书

1.一种适于PCR扩增的燕麦种子DNA大量提取方法，其特征是，包括以下步骤:

(1) 选取燕麦干种子于预冷的研钵中，加入液氮迅速研磨成粉末，将粉末放入第一离心管中； 

(2) 向第一离心管中加入经65℃预热的提取缓冲液，充分颠倒混匀；

(3) 将第一离心管置于65℃中进行水浴，水浴1.5小时，水浴其间每10min温和的颠倒混匀一次；

(4) 取出第一离心管，加入等体积的酚-氯仿（酚-氯仿溶液中，酚和氯仿的体积比为1:1）溶液，温和颠倒混匀，离心；

(5) 离心结束后用吸管吸取上清液，装入第二离心管，加入等体积的氯仿-异戊醇（氯仿-异戊醇溶液中，氯仿和异戊醇的体积比为24:1）溶液，充分颠倒混匀，离心；

(6) 离心结束后将上清液移入第三离心管中，加入预冷的异丙醇，轻轻混匀，低温静置；

(7)勾出DNA到第四离心管中，并用70％的乙醇冲洗2～3次；

(8) 用冷冻干燥机干燥DNA至无乙醇味，再加入1×TE 500μl，RNase 3-5μl，37℃水浴1-2h。

2.根据权利要求1所述的一种适于PCR扩增的燕麦种子DNA大量提取方法，其特征是，步骤(2)中，所述缓冲液成分为3%CTAB(十六烷基三甲基溴化铵)、0.1mol/L 的Tris-HCl (pH 8.0)、1.4mol/L NaCl、0.02 mol/L EDTA(pH8．0)、1% PVP、1% β-巯基乙醇。

3.根据权利要求1所述的一种适于PCR扩增的燕麦种子DNA大量提取方法，其特征是，步骤(2) 中,所述提取缓冲液的加入量为20-22ml。

4.根据权利要求1所述的一种适于PCR扩增的燕麦种子DNA大量提取方法，其特征是，步骤(2)至步骤(6)中，所用到的离心管均为50ml离心管。

5.根据权利要求1所述的一种适于PCR扩增的燕麦种子DNA大量提取方法，其特征是，步骤(4) 和 步骤(5)中，所述离心参数为6000-8000rpm，离心时间5-10min。

6.根据权利要求1所述的一种适于PCR扩增的燕麦种子DNA大量提取方法，其特征是，步骤(6)中，所述异丙醇的加入量为上清液体积的0.6-1倍。

7.一种如权利要求1所述的适于PCR扩增的燕麦种子DNA纯化方法，其特征是，包括以下步骤：

(1) 取出离心管，加入氯仿-异戊醇（氯仿-异戊醇溶液中，氯仿和异戊醇的体积比为24:1），轻轻混匀，12000 rpm，离心5min；

(2)离心结束后，取上清液于第二离心管，加0.1倍体积（相对于上清液体积）3M醋酸钠，混匀后加入2倍体积（相对于上清液体积）预冷的无水乙醇，轻摇混匀，低温静置；

(3) 用移液器吸头勾出DNA至第三离心管，然后用70%的乙醇冲洗2-3次；

(4) 将第三离心管放入冷冻干燥机中，干燥DNA至无乙醇味，依所提DNA的量加入适量的1×TE溶解，使其终浓度为190-210ng/μL。