[发明专利]一种适于PCR扩增的燕麦种子DNA大量提取及纯化方法

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种适于PCR扩增的燕麦种子DNA大量提取及纯化方法。

背景技术

燕麦（Avena L.）是世界上重要的农作物之一，在世界禾谷类作物中的种植面积和总产量居第六位，有很高的营养、食用、保健和饲用价值。迄今为止，我国作物种质资源库的燕麦资源共三千余份，利用现代分子生物技术对这些材料展开深入研究是目前亟待开展的课题。

随着现代分子生物学技术在农作物研究领域的深入发展，基于PCR的分子标记技术，在种子纯度鉴定、种子转基因检测、种质资源多样性研究等领域得到了广泛应用，如RAPD、AFLP、SSR、ISSR、SRAP和SNP等。而在PCR检测过程中，样品 DNA的浓度和纯度是检测成功的关键。

燕麦DNA的提取方法主要有SDS和CTAB法和试剂盒法，试剂盒法成本较高，不适宜用来对大量样品鉴定分析，用SDS法只能提取少量的DNA样品，不能满足现代分子生物学研究中大量组织DNA分析的要求，而CTAB法对燕麦DNA提取的效果要好于SDS，因此，在做AFLP、SSR和ISSR等分子标记时，使用大量的CTAB法提取基因组总DNA是很有必要的。虽然DNA提取方法已被很多研究人员进行优化，但大多数取材都针对叶片进行，取材时需要燕麦生长到一定阶段，耗费周期较长。

发明内容

本发明的目的在于针对上述方法存在的缺点，提出一种成本低，周期短，适于PCR扩增的从燕麦种子大量提取DNA的方法，以解决上述背景技术中提出的问题。该方法省去了种子发芽成苗的周期，且成本低，产量大，效果好，所提DNA产量和质量完全满足进一步的PCR分析，能够应用于燕麦SSR分子标记，为进一步开展燕麦分子遗传研究奠定基础。

为了实现上述目的，本发明的技术方案是：

一种适于PCR扩增的燕麦种子DNA大量提取方法，包括以下步骤:

(1) 选取燕麦干种子于预冷的研钵中，加入液氮迅速研磨成粉末，将粉末放入第一离心管中； 

(2) 向第一离心管中加入经65℃预热的提取缓冲液，充分颠倒混匀；

(3) 将第一离心管置于65℃中进行水浴，水浴1.5小时，水浴其间每10min温和的颠倒混匀一次；

(4) 取出第一离心管，加入等体积的酚-氯仿（酚-氯仿溶液中，酚和氯仿的体积比为1:1）溶液，温和颠倒混匀，离心；

(5) 离心结束后用吸管吸取上清液，装入第二离心管，加入等体积的氯仿-异戊醇（氯仿-异戊醇溶液中，氯仿和异戊醇的体积比为24:1）溶液，充分颠倒混匀，离心；

(6) 离心结束后将上清液移入第三离心管中，加入预冷的异丙醇，轻轻混匀，低温静置；

(7)勾出DNA到第四离心管中，并用70％的乙醇冲洗2～3次；

(8) 用冷冻干燥机干燥DNA至无乙醇味，再加入1×TE 500μl，RNase 3-5μl，37℃水浴1-2h。

步骤(2)中，所述缓冲液成分为3%CTAB(十六烷基三甲基溴化铵)、0.1mol/L 的Tris-HCl (pH 8.0)、1.4mol/L NaCl、0.02 mol/L EDTA(pH8．0)、1% PVP、1% β-巯基乙醇。

步骤(2)中，所述提取缓冲液的加入量为20-22ml。 

步骤(2)至步骤(6)中，所用到的离心管均为50ml离心管。

步骤(4) 和 步骤(5)中，所述离心参数为6000-8000rpm，离心时间5-10min。

步骤(6)中，所述异丙醇的加入量为上清液体积的0.6-1倍。

一种适于PCR扩增的燕麦种子DNA大量提取及纯化方法，包括以下步骤：

(1) 取出离心管，加入氯仿-异戊醇（氯仿-异戊醇溶液中，氯仿和异戊醇的体积比为24:1），轻轻混匀，12000 rpm，离心5min；

(2)离心结束后，取上清液于第二离心管，加0.1倍体积（相对于上清液体积）3M醋酸钠，混匀后加入2倍体积（相对于上清液体积）预冷的无水乙醇，轻摇混匀，低温静置；

(3) 用移液器吸头勾出DNA至第三离心管，然后用70%的乙醇冲洗2-3次；

(4) 将第三离心管放入冷冻干燥机中，干燥DNA至无乙醇味，依所提DNA的量加入适量的1×TE  溶解，使其终浓度为190-210ng/μL。

与现有技术相比，本发明有益效果：