[发明专利]一种无创检测EGFR基因突变的方法及试剂盒有效

申请号：	201310756037.2	申请日：	2013-12-31
公开（公告）号：	CN104745679B	公开（公告）日：	2018-06-15
发明（设计）人：	王丽娜;茹兰兰;李天成;张亚晰;张建光;高扬;周代星	申请（专利权）人：	杭州贝瑞和康基因诊断技术有限公司
主分类号：	C12Q1/6869	分类号：	C12Q1/6869
代理公司：	北京市金杜律师事务所 11256	代理人：	孟凡宏
地址：	310018 浙江省杭州经济技术开发***	国省代码：	浙江;33
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摘要：	本发明涉及一种无创检测受试者中EGFR基因突变的方法，其特征在于，包括以下步骤：针对EGFR基因外显子设计引物；抽提受试者血浆DNA；将上述抽提的血浆DNA与标签接头连接；将上述与标签接头连接的血浆DNA进行PCR预扩增；将所述扩增后的DNA进行环化，得到环化DNA；利用所述引物对所述环化DNA进行PCR扩增；以及对所述PCR扩增的产物进行高通量测序并分析EGFR基因的突变。本发明还涉及有关的试剂盒。 1
搜索关键词：	环化突变接头连接无创检测血浆DNA 试剂盒抽提标签高通量测序受试者血浆设计引物外显子预扩增扩增引物分析
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【主权项】：

1.一种非诊断目的的无创检测受试者中EGFR基因突变的方法，其特征在于，包括以下步骤：

针对EGFR基因外显子设计引物，所述引物是一对相邻且背向延伸的引物对；

抽提受试者血浆DNA；

将上述抽提的血浆DNA与标签接头连接；

将上述与标签接头连接的血浆DNA进行PCR预扩增；

将所述扩增后的DNA进行环化，得到环化DNA；

利用所述引物对所述环化DNA进行PCR扩增；以及

对所述PCR扩增的产物进行高通量测序并分析EGFR基因的突变。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述背向延伸的引物对中的引物均位于所述EGFR基因外显子的5’端或3’端。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述背向延伸的引物对之间间隔所述血浆DNA总碱基对的0‑1/2。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述背向延伸的引物针对EGFR基因外显子18、外显子19、外显子20或外显子21。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述背向延伸的引物5’端含有用于高通量测序文库的接头序列。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述背向延伸的引物针对EGFR基因外显子18、外显子19、外显子20或外显子21，其引物序列分别为：

E18‑1‑3F：CCCAGCTTGTGGAGCCTC

E18‑1‑3R：GACAAGAACACAGAGACAAGGGT

E18‑2‑F：GCAGGGCCTCTCATGGTC

E18‑2‑R：CCTGTGCCAGGGACCTTAC

E19‑1‑F：ACGTCTTCCTTCTCTCTCTGTCAT

E19‑1‑R：GTGAGATGGTGCCACATGCT

E19‑2‑F：GTCCATGGCTCTGAACCTCA

E19‑2‑R：CCACACAGCAAAGCAGAAAC

E20‑1‑F：CACACTGACGTGCCTCTCC

E20‑1‑R：CTTCGCATGGTGGCCAGA

E20‑2‑1F：CCTCCCCGTATCTCCCT

E20‑2‑1R：GGAGATAAGGAGCCAGGAT

E21‑1‑F：AGCAGGGTCTTCTCTGTTTCA

E21‑1‑R：GAGGGACAGATCATCATGGG

E21‑2‑F：TTTCCTGACACCAGGGACC

E21‑2‑R：TGACCTAAAGCCACCTCCTT。

7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述环化采用的是夹板介导的单链DNA环化。

8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述血浆DNA的EGFR基因具有插入、缺失、替换或基因融合突变。

9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，其中所述的高通量测序方法选自Roche/454FLX、Illumina/Hiseq/Miseq、Applied Biosys tems SOLID和life Technologies/Ion Torrent/Proton。

10.一种用于权利要求1所述的方法的无创检测EGFR基因突变的试剂盒，其特征在于，包括血浆DNA提取试剂、DNA环化酶、目标DNA扩增引物及扩增试剂，其中所述DNA扩增引物是一对相邻且背向延伸的引物对。

11.根据权利要求10所述的无创检测EGFR基因突变的试剂盒，其特征在于，进一步包括EGFR基因待检测区域预扩增引物及预扩增试剂。

12.根据权利要求10所述的无创检测EGFR基因突变的试剂盒，其特征在于，进一步包括用于高通量测序的试剂。

13.根据权利要求12所述的无创检测EGFR基因突变的试剂盒，其特征在于，其中所述的用于高通量测序的试剂是用于如下高通量测序技术的：Roche/454FLX、Illumina/Hiseq/Miseq、Applied Biosystems SOLID和life Technologies/Ion Torrent/Proton。

14.根据权利要求10所述的无创检测EGFR基因突变的试剂盒，其特征在于，所述背向延伸的引物对中的引物均位于所述EGFR基因的待检位点或待检区域的5’端或3’端。

15.根据权利要求10所述的无创检测EGFR基因突变的试剂盒，其特征在于，所述背向延伸的引物对之间间隔所述血浆DNA总碱基对的0‑1/2。

16.根据权利要求10所述的无创检测EGFR基因突变的试剂盒，其特征在于，所述背向延伸的引物针对EGFR基因外显子18、外显子19、外显子20或外显子21。

17.根据权利要求10所述的无创检测EGFR基因突变的试剂盒，其特征在于，所述背向延伸的引物针对EGFR基因外显子18、外显子19、外显子20或外显子21，其引物序列分别为：