[发明专利]一种无创检测EGFR基因突变的方法及试剂盒

说明书

本发明涉及一种无创检测受试者中EGFR基因突变的方法，其特征在于，包括以下步骤：针对EGFR基因外显子设计引物；抽提受试者血浆DNA；将上述抽提的血浆DNA与标签接头连接；将上述与标签接头连接的血浆DNA进行PCR预扩增；将所述扩增后的DNA进行环化，得到环化DNA；利用所述引物对所述环化DNA进行PCR扩增；以及对所述PCR扩增的产物进行高通量测序并分析EGFR基因的突变。本发明还涉及有关的试剂盒。

技术领域

本发明涉及基因诊断领域。更具体地，本发明涉及表皮生长因子受体(epidermalgrowth Factor Receptor，EGFR)基因突变的检测方法。本发明还涉及用于EGFR基因突变检测的试剂盒。

背景技术

EGFR即表皮生长因子受体，正常情况下包埋在细胞表面的细胞膜中。EGFR基因长约118kb，包括28个外显子，其编码的是一种170KD的糖蛋白，由1186个氨基酸组成。其是一种对肿瘤细胞的增殖、生长、修复和存活等起重要作用的膜蛋白。目前靶向治疗已经成为非小细胞肺癌(NSCLC)临床治疗的重要手段。易瑞沙(Iressa/吉非替尼/Gefitinib，阿斯利康)和特罗凯(Tarceva/厄罗替尼/Er lot inib，罗氏制药)作为表皮生长因子受体(EGFR)酪氨酸激酶抑制剂(TKI)，是美国FDA批准用于NSCLC靶向治疗的主要药物。但是，临床试验表明易瑞沙和特罗凯仅对10-30％的NSCLC病人有显著疗效。进一步的研究发现EGFR基因突变与NSCLC靶向治疗的疗效具有相关性，绝大多数携带EGFR基因突变的病人疗效显著。大量研究资料表明EGFR基因突变主要集中在酪氨酸激酶区(tyrosine kinase coding domain，18-21外显子)，其中19外显子多为框内缺失(746-753)性突变，约占所有突变的45％；21外显子多为替代突变(主要是L858R)，约占所有突变的40％。目前普遍认为，这两个热点突变可以增强肿瘤细胞对TKI的敏感性，并且可作为TKI治疗的有效预测指标。因此，检测EGFR基因突变对于指导NSCLC病人临床用药具有重要的参考价值。目前临床上使用的EGFR检测方法有：1)传统测序法。该方法的特点是准确性高。但是，传统测序对样品来源要求高，测序时间长，需要对序列进行分析，费用高，限制了其在临床上的使用；2)聚合酶链式反应-单链构象多态性分析(PCR-SSCP)方法。该方法是一种经典的基因突变检测方法，可以对未知的突变进行检测。该方法操作简单，灵敏性高。但是其缺点也很明显，即需要平行的标准对照。假阳性高，当检测小于200bp的PCR产物时，检出率为75-95％，当检测大于400bp的PCR样品时，检出率仅仅为50％左右。3)突变体富集PCR方法：这是一种用限制性内切酶选择性消化野生型EGFR基因的两步PCR。在第一次PCR之后，选择性消化野生型EGFR，从而使突变的EGFR基因得到富集，然后再进行第二次PCR，最后电泳检测PCR产物，然后根据PCR产物的检测结果判定EGFR是否发生突变。该方法的灵敏性高，可以从10³-10⁴个野生型的EGFR中检测到一个突变。但是缺点是需要两次PCR和酶切，过程复杂，费时。另外还有AMRS方法和微数字PCR等技术，但是相关技术在临床上使用仍然需要时间。

因此，在临床上迫切需要一种快速，高效的检测EGFR基因突变的方法。本发明人在研究片段DNA的检测时，发现了一种新的DNA片段的检测方法，即通过对DNA片段的环化，然后对DNA片段进行扩增。在此基础上，结合第二代高通量测序技术，发明人特别根据EGFR基因对该方法进行了改进，并特别根据EGFR设计了优选的引物，开发了一种通过血浆DNA对EGFR基因的突变进行测序和分析的方法以及其试剂盒。

发明内容

根据本发明的一个方面，提供了一种无创检测受试者中EGFR基因突变的方法，其特征在于，包括以下步骤：

针对EGFR基因外显子设计引物；

抽提受试者血浆DNA；

将上述抽提的血浆DNA与标签接头连接；