[发明专利]一种无创检测EGFR基因突变的方法及试剂盒

权利要求书

1.一种非诊断目的的无创检测受试者中EGFR基因突变的方法，其特征在于，包括以下步骤：

针对EGFR基因外显子设计引物，所述引物是一对相邻且背向延伸的引物对；

抽提受试者血浆DNA；

将上述抽提的血浆DNA与标签接头连接；

将上述与标签接头连接的血浆DNA进行PCR预扩增；

将所述扩增后的DNA进行环化，得到环化DNA；

利用所述引物对所述环化DNA进行PCR扩增；以及

对所述PCR扩增的产物进行高通量测序并分析EGFR基因的突变。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述背向延伸的引物对中的引物均位于所述EGFR基因外显子的5’端或3’端。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述背向延伸的引物对之间间隔所述血浆DNA总碱基对的0-1/2。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述背向延伸的引物针对EGFR基因外显子18、外显子19、外显子20或外显子21。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述背向延伸的引物5’端含有用于高通量测序文库的接头序列。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述背向延伸的引物针对EGFR基因外显子18、外显子19、外显子20或外显子21，其引物序列分别为：

E18-1-3F：CCCAGCTTGTGGAGCCTC

E18-1-3R：GACAAGAACACAGAGACAAGGGT

E18-2-F：GCAGGGCCTCTCATGGTC

E18-2-R：CCTGTGCCAGGGACCTTAC

E19-1-F：ACGTCTTCCTTCTCTCTCTGTCAT

E19-1-R：GTGAGATGGTGCCACATGCT

E19-2-F：GTCCATGGCTCTGAACCTCA

E19-2-R：CCACACAGCAAAGCAGAAAC

E20-1-F：CACACTGACGTGCCTCTCC

E20-1-R：CTTCGCATGGTGGCCAGA

E20-2-1F：CCTCCCCGTATCTCCCT

E20-2-1R：GGAGATAAGGAGCCAGGAT

E21-1-F：AGCAGGGTCTTCTCTGTTTCA

E21-1-R：GAGGGACAGATCATCATGGG

E21-2-F：TTTCCTGACACCAGGGACC

E21-2-R：TGACCTAAAGCCACCTCCTT。

7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述环化采用的是夹板介导的单链DNA环化。

8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述血浆DNA的EGFR基因具有插入、缺失、替换或基因融合突变。

9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，其中所述的高通量测序方法选自Roche/454FLX、Illumina/Hiseq/Miseq、Applied Biosys tems SOLID和life Technologies/IonTorrent/Proton。

10.一种用于权利要求1所述的方法的无创检测EGFR基因突变的试剂盒，其特征在于，包括血浆DNA提取试剂、DNA环化酶、目标DNA扩增引物及扩增试剂，其中所述DNA扩增引物是一对相邻且背向延伸的引物对。

11.根据权利要求10所述的无创检测EGFR基因突变的试剂盒，其特征在于，进一步包括EGFR基因待检测区域预扩增引物及预扩增试剂。