[发明专利]杀灭耐药烟曲霉的组合物及方法

摘要

一种杀灭耐药烟曲霉的组合物及方法，属于生物技术领域。一种杀灭耐药烟曲霉的方法，包括制备药物、收集菌株、制备孢子悬液、药物敏感试验和联合药敏试验，先通过本发明步骤获得两性霉素B和肉桂醛的最低抑菌浓度MIC，再利用两性霉素B和肉桂醛不同浓度的药物组合来达到杀灭耐药烟曲霉菌的作用。

主权项

一种杀灭耐药烟曲霉的方法，其特征在于，包括制备药物、收集菌株、制备孢子悬液、药物敏感试验和联合药敏试验，具体检测步骤如下：1）制备药物 将4~5mg两性霉素B和300~500mg肉桂醛，分别用3~5ml 100%的二甲亚砜溶解，并将溶液配成浓度为1280μg/ml和102400μg/ml，于‑20~‑25℃储存；2）收集菌株 收集烟曲霉菌株，质控菌株为近平滑念珠菌； 3）制备孢子悬液 将步骤2）收集的菌株接种到PDA培养皿上，置于35~37℃生化培养箱进行复苏，后转至另一PDA培养皿并置于35~37℃生化培养箱活化3~5天后，用5~10ml含有0.025%吐温20的磷酸盐缓冲液冲洗平皿表面收集孢子，用20~30ml MOPS缓冲的RPMI‑1640重悬孢子，用血细胞计数板调整孢子浓度，并用RPMI‑1640液体培养液调整浓度为1~3×106·孢子·ml‑1，再用RPMI‑1640液体培养基稀释50倍，得到2倍终浓度的孢子悬液；4）药物敏感试验 微量液基稀释法，将步骤1）制备的两性霉素B和肉桂醛分别置于无菌的2个96孔细胞培养板的第1至第10孔，第1孔加入量为100μl，第2~10孔依次以二倍稀释法至终浓度，再将步骤3）制备的孢子悬液加入滴1至第10孔，每孔加入量为1ml，第11孔为步骤3）制备孢子悬液的生长对照孔，第12孔为RPMI‑1640液体培养基，静置于35~37℃培养48h，分别获得两性霉素B和肉桂醛的最低抑菌浓度MIC；5） 联合药物试验 在无菌96孔细胞培养板上加入两性霉素B和肉桂醛，前8列加入两性霉素B和肉桂醛，加入两性霉素B的浓度为1/32~4MIC，添加的量为50μl，加入肉桂醛的浓度为1/32~4MIC，添加的量为50μl，第9列为步骤3）制备孢子悬液的生长对照孔，第10列为无菌对照孔，再将步骤3）制备的孢子悬液加入到96孔板的第1~10列，每孔加入量为100μl，后静置于35~37℃培养48~50h，观察。