[发明专利]一种T-发卡结构介导的测定DNA侧翼未知序列的方法

摘要

发明是一种利用限制性内切酶、T-发卡结构(HSO-T)和巢式PCR扩增等技术，基于已知DNA序列扩增其5′或3′端侧翼未知序列的方法。该方法设计一条HSO-T的寡聚核苷酸序列；用单一限制性内切酶酶切基因组DNA并经rTaq或Ex Taq修饰；HSO-T接头与修饰后基因组连接；根据HSO-T序列合成引物THSO-F，根据已知DNA序列合成2条下游引物或2条上游引物；以连接物为模板，引物THSO-F和2条下游引物进行巢式PCR扩增获得5′端未知序列；同理，引物HSO-F和2条上游引物进行巢式PCR获得3′端未知序列。该技术操作简便、应用范围广、成本低廉、高效准确等优点，具有广阔应的用前景。

主权项

一种T‑发卡结构介导的测定DNA侧翼未知序列的方法，其特征在于：合成一条极易形成发卡结构的寡聚核苷酸序列(HSO‑T)，经变性、退火可形成稳定的HSO‑T接头；基于发卡结构序列，合成特异性引物THSO‑F，再根据已知的DNA序列，合成两条特异性下游引物和两条上游引物；选择单一限制性内切酶酶切基因组DNA，根据酶切产物末端的类型，选择rTaq或Ex Taq进行修饰，修饰后其3′端均被添加上碱基“A”；将HSO‑T接头与经Taq处理的酶切产物进行连接；以连接物为模板，采用THSO‑F和两条下游引物进行巢式PCR扩增，获得已知DNA序列5′端侧翼未知序列；同理，采用THSO‑F和两条上游引物进行巢式PCR扩增，获得3′端侧翼未知序列：(1)T‑发卡结构及PCR引物的合成：根据原核生物回文结构的原理，合成一条极易形成发卡结构的、3′端含有“T”的寡聚核苷酸序列，命名为HSO‑T(42bp)；基于HSO‑T序列，合成一条特异性PCR引物，命名为THSO‑F(20bp)；HSO‑T：5′‑GACTACTGGCATGGGCGGATTACTCGCCCATGCCAGTAGTCT‑3′THSO‑F：5′‑ACTCGCCCATGCCAGTAGTC‑3′(2)上下游引物的合成：基于已知的DNA序列，合成两条扩增已知DNA序列5′端侧翼未知序列的特异性下游引物，命名为Pri‑R1和Pri‑R2，Pri‑R2距离已知DNA序列5′端30bp以上；同理，基于已知的DNA序列，合成两条扩增3′端侧翼未知序列的上游引物，命名为Pri‑F1和Pri‑F2，Pri‑F2距离3′端30bp以上；(3)限制性内切酶的选择：分析已知DNA序列中限制性内切酶的酶切位点，选择在已知DNA序列中没有酶切位点的限制性内切酶；本发明可供选择的、产生5′粘性末端的内切酶有EcoR I、HindIII、Bgl II、Sal I、BamH I、Nco I、Xba I、Xho I、Cla I、Msp I和Nde I等，产生平末端的酶有EcoR V、Sna B和Sca I等，产生3′粘性末端的酶有Aat II、Bmt I、Pst I、Sac I和Sph I等；(4)基因组DNA的酶切：采用步骤(3)选择的单一限制性内切酶对基因组DNA进行完全酶切，纯化酶切产物；(5)酶切产物的修饰：基因组DNA经限制性内切酶酶切后，其酶切产物两端有3种形式，分别为5′粘性末端、3′粘性末端和平末端；针对5′粘性末端，利用rTaq或Ex Taq DNA聚合酶具有不依赖于模板的5′→3′核苷酸聚合活性，将粘性末端补齐，并在3′端添加上碱基“A”；针对平末端，直接利用该两种酶在3′端添加上碱基“A”；针对3′粘性末端，利用Ex Taq DNA聚合酶具有3′→5′核苷酸外切活性，将粘性末端切齐，再利用该酶均具有不依赖于模板的5′→3′核苷酸聚合活性，在3′端添加上碱基“A”；(6)HSO‑T接头与酶切修饰产物的连接：HSO‑T经变性、退火形成HSO‑T接头，将其与 经Taq处理的基因组酶切片段进行连接，即可作为PCR扩增的模板；(7)目的DNA片段的PCR扩增：以步骤(6)的连接物为模板，THSO‑F和Pri‑R1作为上下游引物进行第一轮PCR扩增；再以该轮PCR产物为模板，THSO‑F和Pri‑R2为引物进行第二轮PCR扩增；将两轮PCR(巢式PCR)产物进行琼脂糖凝胶电泳分析；根据巢式PCR原理验证扩增产物是否为目的DNA片段，从而获得已知DNA序列5′端侧翼未知序列；同理，以步骤(6)的连接物为模板，Pri‑F1和THSO‑F作为上下游引物进行第一轮PCR扩增；再以该轮PCR产物为模板，Pri‑F2和THSO‑F为引物进行第二轮PCR扩增；将两轮PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳分析，从而获得已知DNA序列3′端侧翼未知序列。