[发明专利]一种T-发卡结构介导的测定DNA侧翼未知序列的方法

说明书

技术领域

本发明属于生物工程技术领域，是一种涉及限制性内切酶(Restriction Endonuclease)酶切、T-发卡结构(T-Hairpin Structure)连接和巢式PCR(Nest Polymerase Chain Reaction)扩增等技术，基于已知DNA序列测定其侧翼未知DNA序列的方法。

背景技术

在当今的“基因大战”中，新基因的发现与克隆已成为研究的热点，侧翼未知序列的扩增在分子生物学研究中占有举足轻重的地位，是结构基因组研究以及功能基因组研究的基础，可应用于启动子克隆、获得基因的排布信息、确定T-DNA插入位点、染色体定位、图位克隆、基因表达调控研究、人工染色体PAC、YAC和BAC片段搭接等。目前已有的测定侧翼未知序列的方法如随机测序法、3′-和5′-RACE法以及基因组文库进行杂交筛选等，往往工程浩大，费时费力，应用局限或特异性不高。近几年，基于PCR技术克隆侧翼未知序列的方法格外引人注目，该方法包括一类是依赖连接介导的PCR法，如T-inker PCR法等，操作过程相对复杂，且扩增长度较短，非特异扩增的风险较大；另一类是不需要酶切连接的PCR法，如Tail-PCR法等，也存在一定缺陷，比如新Alu-PCR扩增区域包含较短的Alu重复序列时，往往得不到目的产物。由本研究发明两种基于PCR的测定DNA侧翼未知序列技术，操作简便、高效准确等优点，但仍存在一些不足。一种T载体介导PCR测定侧翼未知序列方法，其连接不受限制性内切酶的限制，通用性强，但以pUCm-T为接头连接效率低，且购买pUCm-T价格较贵；另一种以发卡结构介导PCR测定侧翼未知序列，小分子核苷酸链构建的接头结构稳定，大幅度提高了PCR扩增的特异性和效率，但该方法受限制性内切酶的限制，连接位点单一，限制其应用。

发明内容

本发明的目的是提供一种操作简便、应用范围广、成本低廉、高效准确的T-发卡结构介导的PCR扩增方法，能够基于已知DNA序列确定其5′或3′端侧翼未知DNA序列。

本发明的技术方案：合成一条极易形成发卡结构的寡聚核苷酸序列(HSO-T)，经变性、退火可形成稳定的HSO-T接头；基于发卡结构序列，合成特异性引物THSO-F，再根据已知的DNA序列，合成两条特异性下游引物和两条上游引物；选择单一限制性内切酶酶切基因组DNA，根据酶切产物末端的类型，选择rTaq或Ex Taq进行修饰，修饰后其3′端均被添加上碱基“A”；将HSO-T接头与经Taq处理的酶切产物进行连接；以连接物为模板，采用THSO-F和两条下游引物进行巢式PCR扩增，获得已知DNA序列5′端侧翼未知序列；同理，采用THSO-F和两条上游引物进行巢式PCR扩增，获得3′端侧翼未知序列：

(1)T-发卡结构及PCR引物的合成：根据原核生物回文结构的原理，合成一条极易形成发卡结构的、3′端含有“T”的寡聚核苷酸序列，命名为HSO-T(42bp)；基于HSO-T序列，合成一条特异性PCR引物，命名为THSO-F(20bp)；

HSO-T：5′-GACTACTGGCATGGGCGGATTACTCGCCCATGCCAGTAGTCT-3′

THSO-F：5′-ACTCGCCCATGCCAGTAGTC-3′

(2)上下游引物的合成：基于已知的DNA序列，合成两条扩增已知DNA序列5′端侧翼未知序列的特异性下游引物，命名为Pri-R1和Pri-R2，Pri-R2距离已知DNA序列5′端30bp以上；同理，基于已知的DNA序列，合成两条扩增3′端侧翼未知序列的上游引物，命名为Pri-F1和Pri-F2，Pri-F2距离3′端30bp以上；

(3)限制性内切酶的选择：分析已知DNA序列中限制性内切酶的酶切位点，选择在已知DNA序列中没有酶切位点的限制性内切酶；本发明可供选择的、产生5′端粘性末端的内切酶有EcoR I、HindIII、Bgl II、Sal I、BamH I、Nco I、Xba I、Xho I、Cla I、Msp I和Nde I等，产生平末端的酶有EcoR V、Sna B和Sca I等，产生3′端粘性末端的酶有Aat II、Bmt I、Pst I、Sac I和Sph I等；

(4)基因组DNA的酶切：采用步骤(3)选择的单一限制性内切酶对基因组DNA进行完全酶切，纯化酶切产物；