[发明专利]一种人表皮生长因子的制备和纯化方法

摘要

本发明公开了一种人表皮生长因子的制备和纯化方法，包括构建重组质粒pBSAZ1.1myc-His6、构建重组质粒pBSAZ1.1myc-His6-SUMO-hEGF、重组质粒pBSAZ1.1myc-His6-SUMO-hEGF转染CHO细胞和hEGF蛋白的分泌和纯化的步骤。本发明采用现代生物技术，构建了微生物表达载体重组质粒pBSAZ1.1myc-His6-SUMO-hEGF，再将该表达载体转至表达量高，易于纯化以及容易适应大规模工业化发酵生产的CHO细胞，构建稳定的高分泌型工程菌，实现人表皮生长因子的生产。表达产物在分子结构、理化性质和生物学功能方面最接近天然的生物蛋白质分子，经过Balb/c3t3细胞的活性测定实验显示与标准品相比具有较高生物学活性，可达到1×10⁵U/mg。

主权项

一种人表皮生长因子的制备和纯化方法，其特征在于，包括以下步骤：(a) 构建重组质粒pBSAZ 1.1 myc‑His6：提取质粒pcDNA3.1(+)/myc‑His A，经限制性内切酶Bgl II和Stu I双酶切处理，得到3392bp的片段；提取质粒pSecTag2 A，经限制性内切酶Bgl II和Stu I双酶切处理，得到2186bp的片段；将3392bp片段与2186bp片段以体积比2:3的比例用连接酶连接；将连接产物转化大肠杆菌JM109感受态中，经过氨苄青霉素抗性筛选，挑取阳性克隆子，提取质粒并进行限制性内切酶Bgl II和Stu I双酶切鉴定，得到重组质粒pBSAZ 1.1 myc‑His6；(b) 构建重组质粒pBSAZ 1.1 myc‑His6‑SUMO‑hEGF：提取重组质粒pBSAZ 1.1 myc‑His6，经限制性内切酶BamH I和Xho I酶切，得到5525bp的片段，酶切产物纯化后，加去磷酸化酶做去磷酸化处理；提取含hEGF基因片段的质粒pMD18‑T‑His6‑SUMO‑hEGF，经限制性内切酶BamH I和Xho I酶切得到486bp的hEGF基因片段；将5525bp片段与486bp片段以体积比1:4的比例用连接酶进行连接；将连接产物转化大肠杆菌JM109感受态中，经过氨苄青霉素抗性筛选，挑取阳性克隆子，提取质粒并进行限制性内切酶BamH I和Xho I双酶切鉴定，得到重组质粒pBSAZ 1.1 myc‑His6‑SUMO‑hEGF；(c) 重组质粒pBSAZ 1.1 myc‑His6‑SUMO‑hEGF转染CHO细胞：在转染试剂存在下将重组质粒pBSAZ 1.1 myc‑His6‑SUMO‑hEGF转染CHO细胞，筛选得到阳性转化子，将转化子连续传代直至得到稳定细胞株；(d) hEGF蛋白的分泌和纯化：将转染后稳定细胞株于培养基中培养，收集含有分泌的目的蛋白培养基，离心取上清液；亲和层析，用清洗液除去杂蛋白后，加入洗脱液将hEGF洗脱，收集唯一的洗脱峰即为目的蛋白；将含有目的蛋白的样品缓慢加入Ni‑NTA柱，先用破菌缓冲液洗5个柱体积，再用PBS缓冲液洗3个柱体积；最后加入SUMO特异性切割酶Ulp1室温反应10‑30分钟或4℃下2‑6小时；用PBS洗脱酶切下来的hEGF，收集流出液。