[发明专利]一种人表皮生长因子的制备和纯化方法

权利要求书

1.一种人表皮生长因子的制备和纯化方法，其特征在于，包括以下步骤：

(a) 构建重组质粒pBSAZ 1.1 myc-His6：

提取质粒pcDNA3.1(+)/myc-His A，经限制性内切酶Bgl II和Stu I双酶切处理，得到3392bp的片段；

提取质粒pSecTag2 A，经限制性内切酶Bgl II和Stu I双酶切处理，得到2186bp的片段；

将3392bp片段与2186bp片段以体积比2:3的比例用连接酶连接；将连接产物转化大肠杆菌JM109感受态中，经过氨苄青霉素抗性筛选，挑取阳性克隆子，提取质粒并进行限制性内切酶Bgl II和Stu I双酶切鉴定，得到重组质粒pBSAZ 1.1 myc-His6；

(b) 构建重组质粒pBSAZ 1.1 myc-His6-SUMO-hEGF：

提取重组质粒pBSAZ 1.1 myc-His6，经限制性内切酶BamH I和Xho I酶切，得到5525bp的片段，酶切产物纯化后，加去磷酸化酶做去磷酸化处理；

提取含hEGF基因片段的质粒pMD18-T-His6-SUMO-hEGF，经限制性内切酶BamH I和Xho I酶切得到486bp的hEGF基因片段；

将5525bp片段与486bp片段以体积比1:4的比例用连接酶进行连接；将连接产物转化大肠杆菌JM109感受态中，经过氨苄青霉素抗性筛选，挑取阳性克隆子，提取质粒并进行限制性内切酶BamH I和Xho I双酶切鉴定，得到重组质粒pBSAZ 1.1 myc-His6-SUMO-hEGF；

(c) 重组质粒pBSAZ 1.1 myc-His6-SUMO-hEGF转染CHO细胞：在转染试剂存在下将重组质粒pBSAZ 1.1 myc-His6-SUMO-hEGF转染CHO细胞，筛选得到阳性转化子，将转化子连续传代直至得到稳定细胞株；

(d) hEGF蛋白的分泌和纯化：将转染后稳定细胞株于培养基中培养，收集含有分泌的目的蛋白培养基，离心取上清液；亲和层析，用清洗液除去杂蛋白后，加入洗脱液将hEGF洗脱，收集唯一的洗脱峰即为目的蛋白；将含有目的蛋白的样品缓慢加入Ni-NTA柱，先用破菌缓冲液洗5个柱体积，再用PBS缓冲液洗3个柱体积；最后加入SUMO特异性切割酶Ulp1室温反应10-30分钟或4℃下2-6小时；用PBS洗脱酶切下来的hEGF，收集流出液。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤c中所述的CHO细胞的培养方法为：100mm的培养皿中以3×10⁶个细胞的浓度接种CHO细胞，培养基为含5%的小牛血清的DMEM/F12培养基，转染前一天加入7ml含血清，不含抗生素的培养基，37℃置于恒温培养箱，5%CO₂培养，至转染时要求80%-90%细胞汇合。

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤c中的转染方法具体为：分别把4ug的pBSAZ 1.1 myc-His6-SUMO-hEGF质粒和12ul的转染试剂稀释到200ul无血清培养基中，室温放置五分钟再混合，将混合液在室温放置10―15分钟后滴入CHO细胞培养基中，培养4h后换液，继续筛选培养24-48小时得到阳性转化子，将转化子连续传代直至得到稳定细胞株。

4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤d中所述的清洗液含有20mmol/L咪唑，300mmol/L NaC，150 mmol/L NaH2PO4，pH值为8.0。

5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤d中所述的洗脱液含有250mmol/L咪唑，300mmol/L NaCl，150 mmol/L NaH₂PO₄，pH值为8.0。

6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤d中所述SUMO特异性切割酶Ulp1由以下方法制备得到：

(a) 构建重组质粒pET-28a-Ulp1：提取含Ulp1基因片段的质粒pMD18-T-Ulp1，经限制性内切酶Nde I和Xho I酶切得到Ulp1基因片段；与经同样双酶切的质粒pET-28a连接得到pET-28a-Ulp1；

(b) 构建重组菌株BL21/pET-28a-Ulp1：将重组质粒pET-28a-Ulp1加入感受态细胞BL21，冰上放置30分钟，然后42℃水浴中热激90-120秒，冰上放置2-3分钟，涂布含卡那霉素抗性的LB固体培养基平板，置37℃恒温培养箱过夜培养；

(c) Ulp1的诱导表达及纯化：挑取重组菌株BL21/pET-28a-Ulp1单克隆于含卡纳青霉素的LB液体培养基中，37℃振荡过夜培养，待OD₆₀₀值0.6-0.8时加入IPTG至终浓度0.2mM，22℃诱导过夜；离心收菌，用破菌缓冲液重悬沉淀，加入PMSF，超声波破菌；细菌破碎液离心，取上清；上Ni-NTA柱纯化，Ni-NTA洗脱下来了的蛋白用FPLC进一步纯化。