[发明专利]一种人表皮生长因子的制备和纯化方法

说明书

技术领域

本发明属于生物工程领域，特别涉及一种人表皮生长因子的制备和纯化方法。。

背景技术

人表皮生长因子(Human Epidermal Growth Factor，简称hEGF)是一种含有53个氨基酸的单链多肽，分子量为6216道尔顿。hEGF是一种多功能细胞生长因子，通过与细胞膜上hEGF受体结合发挥生理作用。研究表明：表皮细胞、成纤维细胞、内皮细胞以及平滑肌细胞等多种细胞的细胞膜上都含有hEGF受体，其中表皮细胞含量最高。hEGF接近细胞后与细胞膜上的hEGEF受体结合，促使细胞内部发生一系列复杂的生化级联反应，使得RNA、DNA和蛋白质合成增加，最终促进细胞生长繁殖，加速细胞新陈代谢。

人的尿液、血液、乳汁及胃液等含有的内源性hEGF很少，并且为与受体结合的生理状态，从生物来源中提取hEGF比较困难，仅仅限于理论研究。目前生产hEGF主要有2种途径：一种是化学合成法，虽然产物纯度高但是产率不高，而且蛋白质不能像生物合成一样折叠，无法工业化生产。另一种方法是采用基因工程技术构建重组质粒表达hEGF。基因重组hEGF的基本策略是首先从制备hEGF目的基因，然后将目的基因连接至表达载体上，从而构建出含hEGF目的基因的重组质粒，最后将质粒转化至基因工程菌中表达，分离纯化得到hEGF目的蛋白。目前表达载体主要有大肠杆菌和酵母菌，hEGF在这两种表达载体中的表达量小，发酵液中的产物浓度低，提取和纯化工艺复杂，而且所获得的hEGF活性不高。

发明内容

本发明的目的在于提供提供一种高效、稳定的表达hEGF工程菌的构建、筛选，以及分离纯化目的蛋白hEGF的方法，解决重组人表皮生长因子在哺乳动物细胞中国仓鼠卵巢细胞（CHO细胞）中分泌表达的问题。

一种人表皮生长因子的制备和纯化方法，其特征在于，包括以下步骤：

(a) 构建重组质粒pBSAZ 1.1 myc-His6：

提取质粒pcDNA3.1(+)/myc-His A，经限制性内切酶Bgl II和Stu I双酶切处理，得到3392bp的片段；

提取质粒pSecTag2 A，经限制性内切酶Bgl II和Stu I双酶切处理，得到2186bp的片段；

将3392bp片段与2186bp片段以体积比2:3的比例用连接酶连接；将连接产物转化大肠杆菌JM109感受态中，经过氨苄青霉素抗性筛选，挑取阳性克隆子，提取质粒并进行限制性内切酶Bgl II和Stu I双酶切鉴定，得到重组质粒pBSAZ 1.1 myc-His6；

(b) 构建重组质粒pBSAZ 1.1 myc-His6-SUMO-hEGF：

提取重组质粒pBSAZ 1.1 myc-His6，经限制性内切酶BamH I和Xho I酶切，得到5525bp的片段，酶切产物纯化后，加去磷酸化酶做去磷酸化处理；

提取含hEGF基因片段的质粒pMD18-T-His6-SUMO-hEGF，经限制性内切酶BamH I和Xho I酶切得到486bp的hEGF基因片段；

将5525bp片段与486bp片段以体积比1:4的比例用连接酶进行连接；将连接产物转化大肠杆菌JM109感受态中，经过氨苄青霉素抗性筛选，挑取阳性克隆子，提取质粒并进行限制性内切酶BamH I和Xho I双酶切鉴定，得到重组质粒pBSAZ 1.1 myc-His6-SUMO-hEGF；

(c) 重组质粒pBSAZ 1.1 myc-His6-SUMO-hEGF转染CHO细胞：在转染试剂存在下将重组质粒pBSAZ 1.1 myc-His6-SUMO-hEGF转染CHO细胞，筛选得到阳性转化子，将转化子连续传代直至得到稳定细胞株；

(d) hEGF蛋白的分泌和纯化：将转染后稳定细胞株于培养基中培养，收集含有分泌的目的蛋白培养基，离心取上清液；亲和层析，用清洗液除去杂蛋白后，加入洗脱液将hEGF洗脱，收集唯一的洗脱峰即为目的蛋白；将含有目的蛋白的样品缓慢加入Ni-NTA柱，先用破菌缓冲液洗5个柱体积，再用PBS缓冲液洗3个柱体积；最后加入SUMO特异性切割酶Ulp1室温反应10-30分钟或4℃下2-6小时；用PBS洗脱酶切下来的hEGF，收集流出液。