[发明专利]利用RT-LAMP快速检测甘蔗花叶病毒的方法

摘要

一种利用RT-LAMP快速检测甘蔗花叶病毒的方法，包括如下步骤：根据NCBI上提供的甘蔗花叶病毒的序列设计4条LAMP特异引物F3、B3、FIP、BIP，样品提取RNA反转录成cDNA之后进行RT-LAMP反应，通过对反应体系的设计和优化，在一个恒温水浴锅反应1h可以完成扩增，扩增产物可以通过电泳或者荧光染料实现检测，是一种操作简单、快速、灵敏而经济的检测方法。

主权项

利用RT‑LAMP快速检测甘蔗花叶病毒的方法，其特征在于，包括如下步骤：1）根据NCBI已报道的甘蔗花叶病毒的CP蛋白的核苷酸序列，通过多序列比对选择相对保守序列，通过在线LAMP引物设计软件primerExplorer V4设计4条引物，其中包括2条外引物F3/B3和2条内引物FIP/BIP；2)利用RNAiso Plus法提取甘蔗植株的总RNA；3）利用M‑MLV反转录酶把提取的RNA转化为cDNA；4)设置不同的Mg2+浓度、dNTPs的浓度以及甜菜碱的浓度，确定最佳反应体系；分别改变反应的温度进行RT‑LAMP扩增反应，RT‑LAMP反应温度为63℃，反应时间为60‑80min；5）RT‑LAMP反应体系为：外引物F3和B3各0.25μM，内引物FIP和BIP各1.5μM，Bst DNA聚合酶（8U）1μL，10×Bst buffer2.5μL，甜菜碱2μL，25mM MgSO41μL，dNTP1.4mM，模版2μL，DEPC处理的灭菌水加至25μL，63℃条件下反应时间为60min，80℃灭活5min；以未感染样品作为阴性对照验证这一方法的特异性；6）实验结果通过肉眼判断和利用1.5%的电泳检测进行验证或者荧光染料检测可以检测出甘蔗花叶病毒。