[发明专利]利用RT-LAMP快速检测甘蔗花叶病毒的方法

权利要求书

1.利用RT-LAMP快速检测甘蔗花叶病毒的方法，其特征在于，包括如下步骤：

1）根据NCBI已报道的甘蔗花叶病毒的CP蛋白的核苷酸序列，通过多序列比对选择相对保守序列，通过在线LAMP引物设计软件primerExplorer V4设计4条引物，其中包括2条外引物F3/B3和2条内引物FIP/BIP；

2)利用RNAiso Plus法提取甘蔗植株的总RNA；

3）利用M-MLV反转录酶把提取的RNA转化为cDNA；

4)设置不同的Mg²⁺浓度、dNTPs的浓度以及甜菜碱的浓度，确定最佳反应体系；分别改变反应的温度进行RT-LAMP扩增反应，RT-LAMP反应温度为63℃，反应时间为60-80min；

5）RT-LAMP反应体系为：外引物F3和B3各0.25μM，内引物FIP和BIP各1.5μM，Bst DNA聚合酶（8U）1μL，10×Bst buffer2.5μL，甜菜碱2μL，25mM MgSO41μL，dNTP1.4mM，模版2μL，DEPC处理的灭菌水加至25μL，63℃条件下反应时间为60min，80℃灭活5min；以未感染样品作为阴性对照验证这一方法的特异性；

6）实验结果通过肉眼判断和利用1.5%的电泳检测进行验证或者荧光染料检测可以检测出甘蔗花叶病毒。

2.根据权利要求1所述的利用RT-LAMP快速检测甘蔗花叶病毒的方法，其特征在于，所述2条外引物F3/B3和2条内引物FIP/BIP的序列为：

F3:5-TGGAYGGAGATGAACAAAGA-3

B3:5-AATGCATACCGCGCTAAG-3

FIP:5-GCTGCATCACTGAAATGATGCATTA-CCRTTAAAACCAGTTA

    TTGAAAACG-3

BIP:5-TCGAGTAYAGAAACTCTACAGAGCG-TATAGTCGGTGAGATTT

    CGC-3。