[发明专利]利用高分辨熔解曲线分析技术检测华法林个体化用药相关基因多态性的方法

摘要

本发明公开了一种利用高分辨熔解曲线分析技术检测华法林个体化用药相关基因多态性的方法，其特征在于所述方法包括以下步骤：采用硅胶吸附法抽提被测者口腔上皮细胞/外周血细胞样本的基因组DNA，设计包含目标位点的检测引物，根据HRM分析技术对PCR扩增后的基因序列进行位点分型。本发明灵敏度高、特异性好，检测速度快，可用于为华法林的临床用药剂量提供参考，从而达到合理有效地个体化用药。

主权项

一种利用高分辨熔解曲线分析技术检测华法林个体化用药相关基因多态性的方法，其特征在于，具体步骤为：第一步：采用硅胶吸附法抽提被测者口腔上皮细胞/外周血细胞样本的基因组DNA，电泳凝胶成像法对DNA的浓度和纯度作检测，待测样本浓度标化到10ng/ul;第二步：采用在线软件Primer 3设计HRM引物，确定最佳引物为18‑25bp大小，PCR产物长度80‑150bp，相关引物信息如下：CYP2C9 Arg144Cys（rs1799853）引物序列：rs1799853‑F：AATTTTGGGATGGGGAAGAGrs1799853‑R：CCACCCTTGGTTTTTCTCAACYP2C9 A1075C（rs1057910）引物序列：rs1057910‑F：CCACATGCCCTACACAGATGrs1057910‑R：TGTCACAGGTCACTGCATGGVKORC1 C1173T（rs9934438）引物序列：rs9934438‑F：CCGAGAAAGGTGATTTCCAArs9934438‑R：TGACATGGAATCCTGACGTG第三步：在每一个PCR反应孔中依次加入Type‑it HRM PCR Mix 7.5ul，正、反向引物溶液各0.5ul（10umol/L），检测样品2ul，用灭菌重蒸馏水补足15ul；在Rotor‑Gene Q上进行反应，PCR反应条件为92‑97℃变性5‑15分钟，92‑97℃变性10‑30秒，57‑65℃退火10‑30秒，70‑75℃延伸10‑30秒，30‑50个循环；HRM反应条件：92‑97℃变性1分钟，40℃复性1分钟，初始熔解温度60‑65℃开始程序升温熔解至95℃，过程中实时监测荧光信号，30‑50次每秒;第四步：应用Rotor‑Gene Q软件分析HRM结果，通过标准曲线基于曲线偏移（纯合子）和曲线形状变化（杂合子）展现不同的基因型；定义已知样本基因型后，软件会自动调出所有检测样本的基因型。