[发明专利]利用高分辨熔解曲线分析技术检测华法林个体化用药相关基因多态性的方法

说明书

技术领域

本发明涉及华法林个体化用药相关基因多态性的检测方法，属于分子生物学技术领域。

背景技术

华法林是临床上常用的抗凝药物，通过抑制凝血因子的活化抑制新的血栓形成，限制血栓的扩大和延展，抑制血栓脱落和栓塞的发生,有利于血栓的清除。临床上主要用于治疗房颤、心瓣膜修复术、再发性的中风、深静脉血栓以及肺动脉栓塞。华法林药理学作用比较复杂，即使很小的剂量-反应变化也可能导致血栓或出血。临床用药剂量可以相差20倍左右，如何正确使用华法林，合理监测调整剂量，已成为困扰临床医生的难题。华法林主要由肝细胞微粒体细胞色素P450 2C9酶羟基化后，由肾脏排出体外。另一方面华法林通过抑制维生素K环氧化物还原酶，阻止维生素K还原形式KH2的形成。KH2通过对维生素K依赖性凝血因子Ⅱ、Ⅶ、Ⅸ、Ⅹ氨基末端谷氨酸残基的γ-羧化作用，使其具有生物活性，促进凝血因子结合于磷脂表面，加速凝血过程。研究发现CYP2C9和VKORC1是华法林代谢个体差异最主要的两个遗传学方面的影响因素，其基因多态性变量约占香豆素类药初始剂量和维持剂量的35%～50%。

细胞色素氧化酶P450是一类参与内源性和外源性化合物代谢的单加氧酶，与大部分药物及毒物的代谢有关。甲CYP2C9在人肝脏微粒体中含量丰富，约占总CYP蛋白量的20%，有多种突变等位基因，构成了药物代谢个体差异的基础。影响CYP2C9酶催化功能的突变体主要有两种：CYP2C9*2和CYP2C9*3。研究发现携带CYP2C9*2等位基因的个体与野生型个体华法林的临床用药剂量相比要降低14%～20%，携带CYP2C9*3等位基因的个体与野生型个体华法林的临床用药剂量相比要降低21%～49%。突变型可以使华法林的代谢减慢，血药浓度增高，引起出血等不良反应的发生。

维生素K环氧化物还原酶1（vitamin K epoxide reductase 1，VKORC1）可激活维生素K环氧化物还原酶复合体，主导维生素K依赖性凝血因子的生成，是华法林主要作用靶点。VKORC1基因位于内含子区的1173 C>T多态性能更多显示华法林个体剂量的差异。一项研究发现携带VKORC1(1173CC+CT)基因型的病人每天华法林的用药剂量( 3.33±1.04 mg/d)比携带1173TT基因型所需要的华法林的用药剂量(1.81 ±0.63 mg/d )高(P＜0.001)。 

目前普遍应用的基因分型检测方法为Taqman探针法和DNA直接测序法。Taqman荧光探针两端分别标记报告基团和淬灭基团，探针在未与目标序列结合保持完整时，荧光报告基团和淬灭基团没有分离，荧光信号被淬灭基团吸收，不能受激发出荧光；PCR扩增时，完全互补配对后由Taq酶所具有的5’-3’外切酶活性将探针酶切降解，荧光报告基团和淬灭基团分离，荧光检测系统可以接到荧光信号，实现荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步。如果探针与目标序列存在错配碱基，就会大大减少探针与目标序列结合的紧密度及Taq酶5’端外切酶的活性，影响探针的荧光释放量，使带有不同碱基的DNA序列得以鉴定。这种方法步骤少，不易污染，便于对大样本进行分型；但对引物设计有一定的限制，对于SNP附近的序列有一定要求，受突变碱基位点与类型局限。DNA直接测序法能直接提供准确的碱基信息，被当成突变检测的金标准，但存在费时费力，成本较昂贵，不适用于对大量样本进行检测等缺点。

本发明应用一种全新的突变扫描和基因分型的遗传分析方法——高分辨熔解曲线（High resolution melting，HRM）分析技术。通过实时监测升温过程中双链DNA荧光染料与PCR产物的结合情况，SNP位点碱基不同会使双链DNA的TM值发生变化从而双链DNA在升温过程中先后解开，形成不同的熔解曲线形状，荧光染料从局部解链的DNA分子上释放，从荧光强度与时间曲线上就可以判断是否存在SNP，而且不同SNP位点、杂合子与纯合子等都会影响熔解曲线的峰形，能够有效区分不同SNP位点与不同基因型。HRM不受突变碱基位点与类型局限，无需序列特异性探针，采用新型饱和染料更易于检测单碱基突变、小片段插入或缺失。该方法与其他遗传分型技术相比，操作简单，具有灵敏度高、特异性好、成本低、快速、高通量检测等优点，结果准确，且实现了真正的闭管操作。

发明内容

本发明的目的是提供一种简单易行的华法林个体化用药相关基因多态性的检测方法。