[发明专利]新型等温多自配引发扩增技术(IMSA)

摘要

本发明涉及到一种新型的等温核酸扩增技术，即等温多自配引发扩增技术(IMSA)。该技术无需热循环仪器，在等温条件和单一功能性酶作用下即可实现对病原基因的扩增。等温多自配引发扩增技术(IMSA)的结果判定可通过观察副产物焦磷酸镁白色沉淀、于扩增前或后加入显色剂观察颜色变化等简单措施实现。其最大特点是，在扩增过程中会产生多倍数的能自我配对继而引发循环扩增的寡核苷酸结构，使得随后循环扩增引发几率明显增加，继而使得扩增效率和检测灵敏度提升。于此，基于等温多自配引发扩增技术(IMSA)我们建立了对手足口病病原柯萨奇病毒A16型(CVA16)和人肠道病毒EV71型(EV71)的VP1基因的检测，以及对人甲型H7N9流感病毒的HA基因的快速检测方法。该发明可实现简单、快速、高灵敏性高特异性检测。

主权项

1.一种利用改进的等温多自配引发扩增方法检测病原微生物的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括用于等温核酸扩增方法的四条混合式引物两条非混合式引物，以及羟基萘酚蓝染料或羟基萘酚蓝染料与GeneFinder TM的混合染料，其中，当所述检测病原微生物为手足口病病原柯萨奇病毒A16时，所述四条混合式引物的序列分别为：CVA16‑DsF:5’TTGTCACTAGCATTAGACGACGCCAGATTAGGCACTGGTGTTG3’;CVA16‑DsR :5’CAGGAGACAGCCATTGGGACGTGGTGGGCATTGTGA3’;CVA16‑FIT:5’T GGAATGATGGTTCAACACACATCTAAGCCGCGGAGACAGG3’;CVA16‑RIT :5’AGATGTGTGTTGAACCATCATTCCACTGACAAGACCAGCACGG3’;两条非混合式引物的序列分别为：CVA16‑SteR：5’ TTGTCACTAGCATTAGACGACGC3’;CVA16‑SteF :5’CAGGAGACAGCCATTGGGA3’，所述引物CVA16‑DsF和引物CVA16‑DsR组成的引物对：所述引物CVA16‑FIT和所述引物CVA16‑RIT组成的引物对：引物CVA16‑SteR和引物 CVA16‑SteF组成的引物对=1 ：4 ：8；当所述检测病原微生物为人肠道病毒 EV71 时，所述四条混合式引物的序列分别为：EV71‑DsF:5’ ACCATTGATAAGCACTCGCAGGGTCAAGCTGTCAGACCCTCC3’;EV71‑DsR:5’ GAACACAAACAGGAGAAAGATCTTGTGAGAACGTGCCCATCA3’;EV71‑FIT :5’TCCGAATGTGGGATATCCGTCATAAGTTTCAGTGCCATTCATGTCEV71‑RIT:5’ TTATGACGGATATCCCACATTCGGAAGGACATGCCCCGTATT3’,两条非混合式引物的序列分别为：EV71‑SteR :5’ACCATTGATAAGCACTCGCAGG3’EV71‑SteF:5’GAACACAAACAGGAGAAAGATCTTG3’,所述引物EV71‑DsF 和所述引物 EV71‑DsR组成的引物对：所述引物EV71‑FIT和所述引物 EV71‑RIT组成的引物对：所述引物EV71‑SteR和所述引物 EV71‑SteF组成的引物对 =1 ：4 ：8；当所述检测病原微生物为人甲型 H7N9 流感病毒的 HA 基因时，所述四条混合式引物的序列分别为：H7‑DsF:5’ GCCTGATTCTCTGAGAATTTGCCTTGATGTCTGTTATCCTGGGA3’;H7‑DsR:5’ ACAGTGGAATAAGAACTAATGGAGCGAGCCATTTCATTTCTGCA3’;H7‑FIP:5’ GAATCCCATTGCTTCCTTGTCACGTGAATGAAGAAGCTCTG3’;H7‑RIT :5’TGACAAGGAAGCAATGGGATTCTCCTGATCTCCTACATGCA3’;两条非混合式引物的序列分别为：H7‑SteR:5’ GCCTGATTCTCTGAGAATTTGCCT3’;H7‑SteF:5’ ACAGTGGAATAAGAACTAATGGAGC3’，所述引物H7‑DsF和 H7‑DsR组成的引物对：所述引物H7‑FIP和所述引物 H7‑RIT组成的引物对：所述引物H7‑SteR和所述引物 H7‑SteF组成的引物对 =1 ：4。