[发明专利]新型等温多自配引发扩增技术(IMSA)

说明书

本发明涉及到一种新型的等温核酸扩增技术，即等温多自配引发扩增技术(IMSA)。该技术无需热循环仪器，在等温条件和单一功能性酶作用下即可实现对病原基因的扩增。等温多自配引发扩增技术(IMSA)的结果判定可通过观察副产物焦磷酸镁白色沉淀、于扩增前或后加入显色剂观察颜色变化等简单措施实现。其最大特点是，在扩增过程中会产生多倍数的能自我配对继而引发循环扩增的寡核苷酸结构，使得随后循环扩增引发几率明显增加，继而使得扩增效率和检测灵敏度提升。于此，基于等温多自配引发扩增技术(IMSA)我们建立了对手足口病病原柯萨奇病毒A16型(CVA16)和人肠道病毒EV71型(EV71)的VP1基因的检测，以及对人甲型H7N9流感病毒的HA基因的快速检测方法。该发明可实现简单、快速、高灵敏性高特异性检测。

技术领域：

本发明涉及到一种新型的等温核酸扩增技术，其主要特点是在等温条件下扩增过程中会产生多倍数的能自我配对继而引发循环扩增的特殊核苷酸结构。本发明能够被应用于病原基因的快速、高灵敏性和高特异性检测，实现对疾病病原现场快速检测。

背景技术：

近几十年来，核酸扩增技术为分子生物研究和病原微生物检测做出了革命性的贡献。到目前为主，核酸扩增技术主要基于两种策略：一种是通过具备热循环仪器实现升温降温来完成模板核酸解链、引物退火结合模板以及随后引物延伸的三个过程；另一种是在等温条件和特殊功能性酶作用下完成前述三个过程。

聚合酶链式反应(PCR)就是典型的基于热循环的核酸分子扩增技术。随着PCR的不断发展，其许多相关性的改进技术也不断被开发出来，如多重PCR、巢式PCR、实时PCR及逆转录PCR等。PCR技术虽然被广泛采用并作为分子诊断的标准分析技术，但是在现场和床旁检测(POCT)中却受到限制，这与它本身无法逾越的缺陷有关。一方面，PCR必须依赖不易携带的热循环仪器；另一方面，对于PCR结果处理操作过于繁冗。此外，在扩增时间上PCR难以满足快速的需求。而等温技术却能在POCT上发挥独特优势。等温技术可以在简单的恒温装置如水浴锅中实现扩增，且同PCR比，其能在短时间达到同等扩增效果或具备更高的检测线水平。但是，考虑到成本和稳健性因素，并不是所有的等温技术都具备POCT应用价值，如链置换扩增(SDA)和等温嵌合引物引发核酸扩增(ICAN)等。这两种等温技术需要至少两种以上的特殊功能性酶，而且扩增不稳健，需要繁琐的体系优化。因此，快速、灵敏、有成本效益的稳健性等温技术才是POCT真正的需求。

基于此，我们发明了一种新型的等温核酸扩增技术，即等温多自配引发扩增(isothermal multiple self-matching-initiated amplification,IMSA)。该发明是从一种高特异性、一管式密闭巢式PCR即聚合酶链置换反应(PCDR)技术中得到启发。虽然PCDR具备快速检测性，但其同普通PCR一样在POCT应用上受到阻碍。于此，在IMSA技术中，我们将PCDR技术中的四条引物(内外各一对)进行了特殊的改变，引入四条混合式具备自我配对功能的引物，使得其不需要热循环仪器，在等温条件和单一功能性酶下，即可实现对病原基因的快速、高灵敏、高特异扩增。在结果判定上，IMSA能够通过观察副产物焦磷酸镁白色沉淀、于扩增前或后加入显色剂观察颜色变化等简单措施进行判定。IMSA技术最大特点就是，在等温核酸扩增过程中会产生多倍数的能自我配对继而引发循环扩增的特殊核苷酸结构。这种结构的大量产生富集，使得随后循环扩增引发几率明显增加，继而使得扩增效率增加，最终使得检测灵敏度提升。

发明内容：