[发明专利]一种基于桥式PCR检测DNA羟甲基化的方法

摘要

本发明公开了一种基于桥式PCR的DNA羟甲基化的高通量芯片检测方法，首先将不同扩增DNA羟甲基化位点的正方向引物固定到芯片或微球。其次，用β-葡萄糖基转移酶将DNA上所有5hmC进行糖基化，再用MspI酶进行酶切，发生羟甲基化的CCGG不能够被切开，未发生羟甲基化的CCGG能够被切开。然后，再以酶切后基因组DNA为模板与芯片进行杂交，并进行在片桥式PCR:CCGG位点发生羟甲基化的因不能被酶切，而能够进行扩增；反之，CCGG位点未发生羟甲基化的因能被酶切，而不能进行扩增。最后，根据芯片不同矩阵点荧光的有无，即可判断出基因组DNA不同位置的CCGG是否发生了羟甲基化。有益效果是：实现了不同DNA羟甲基化位点的平行性检测，检测结果具有高通量和高灵敏的特点。

主权项

一种基于桥式PCR检测DNA羟甲基化的方法，其特征是：首先将不同扩增DNA羟甲基化位点的正反向引物固定到芯片或微球；其次，用β‑葡萄糖基转移酶将DNA上所有5hmC进行糖基化，再用MspI酶进行酶切，发生羟甲基化的CCGG不能够被切开，未发生羟甲基化的CCGG能够被切开；然后，再以酶切后基因组DNA为模板与芯片进行杂交，并进行在片桥式PCR: CCGG位点发生羟甲基化的因不能被酶切，而能够进行扩增；反之，CCGG位点未发生羟甲基化的因能被酶切，而不能进行扩增；最后，根据芯片不同矩阵点荧光的有无，判断出基因组DNA不同位置的CCGG是否发生了羟甲基化；   其中所述反向引物长为27bp:近5’端7个bp为T,近3’端20bp与每个CCGG位点的CGG后，包括CGG所在序列反向互补；反向扩增引物序列为CCGG被MspI酶切后CGG+的反向互补序列；正向引物长为20bp,且正向扩增引物序列为待检测CCGG 位点近5’端的125 bp处一段序列；相邻微阵列点间的距离设为80um。