[发明专利]抗氧化肽及其制备方法

摘要

本发明涉及抗氧化肽及其制备方法。本发明利用青养蛋白，通过酶法水解，得到青养蛋白酶解液，再利用超滤膜、离子交换色谱、凝胶过滤色谱及反相高效液相色谱对其进行分离纯化得到一种新的抗氧化肽产品，并测定其氨基酸序列。该产品的氨基酸序列为Leu-Lys(259.1607Da)和Phe-Lys(293.1446Da)，具有很强的抗氧化作用，氧自由基吸收能力是粗肽的7.83倍和15.78倍，而且该肽具有分子量小、可被人体直接吸收的特点，因此可以广泛应用于食品、保健品及化妆品等领域。

主权项

1.抗氧化肽的制备方法，其特征在于该方法步骤如下：（1）青养蛋白酶解物的制备：将青养肉与水按质量比1:1～1:4混合，加入加入Papain或Flavourzyme中的一种或两种，在50～55℃酶解4～20h；85～95℃下灭酶15～30min，离心，取上清液，得到青养蛋白酶解液；（2）抗氧化肽的分离纯化：将青养蛋白酶解液分别通过截留分子量为5000Da和1000Da的超滤膜，滤去大分子，取透过液，冷冻干燥成粉末；用AmberliteIRC50阳离子交换柱(3.6×60cm)进行分离，分别用pH值为5、10、12的50mM乙酸铵缓冲液进行洗脱，洗脱速度为2-7mL/min，检测波长为214nm；再用SephadexG-15凝胶柱(1.6×100cm)进行分离纯化，用去离子水以0.5～2ml/min的流速进行洗脱，检测波长为214nm，测定各洗脱峰对应组分的抗氧化活性，收集活性最高的两个组分，然后冷冻干燥得活性最高的粉末B2和活性次高的粉末B3；（3）将粉末B2和粉末B3分别溶于水后，再分别用反相高效液相色谱进一步纯化，分别得到活性组分B2-c和活性组分B3-a，其中纯化条件为：色谱柱为XBridge^TMpreC₁₈柱(5μm,10×150mm;Waters,USA)，流动相为A相（已腈）-B相（0.1%三氟乙酸V/V），洗脱程序为：在0-4min内采用的流动相中A、B的体积百分比分别为5%和95%；在4-8min内采用的流动相中A、B的体积百分比分别为10%和90%；在8-12min内采用的流动相中A、B的体积百分比分别为20%和80%，在12-30min内采用的流动相中A、B的体积百分比分别为50%和50%，流速为1.5-4ml/min，检测波长为215nm，测定各洗脱峰对应组分的抗氧化活性，收集活性最高的峰；（4）将收集到的活性组分B2-c和活性组分B3-a分别用高效液相再一次纯化，得到活性组分B2-c-2和活性组分B3-a-2，再进行冷冻干燥，得到目标肽；所述纯化的条件为：色谱柱为XBridge^TMC₁₈柱（5μm,4.6×150mm;Waters,USA）,流动相为A相（已腈）-B相（0.1%三氟乙酸V/V），洗脱程序为：在0-4min内采用的流动相中A、B的体积百分比分别为5%和95%；在4-8min内采用的流动相中A、B的体积百分比分别为10%和90%；在8-12min内采用的流动相中A、B的体积百分比分别为15%和85%，在12-30min内采用的流动相中A、B的体积百分比分别为30%和70%，流速为0.6-1ml/min，检测波长为215nm。