[发明专利]一种利用正常人多种皮肤细胞筛查皮肤抗氧化剂安全和功效的方法

摘要

本发明公开了一种利用正常人多种皮肤细胞筛查皮肤抗氧化剂安全和功效的方法，含以下步骤：(1)正常人原代细胞的分离、培养和鉴定；(2)受试物的毒性检验；(3)受试物的配制及其浓度的确定；(4)紫外线诱导辐射剂量的确定；(5)受试物抗氧化效果的确认。本发明通过体外标准化培养的正常人皮肤细胞，其分裂增殖能力强、标准化程度高、批间差异小，具有与体内相同的活性和功能；本发明利用正常健康人皮肤细胞比动物或人源的细胞系获得的结果更可信；本发明可以从定性和定量两方面评价待测物质的毒性作用和抗氧化功效。本发明方法可以代替活体动物和人类皮肤，直接用于化学品、化妆品、药品等产品中抗氧化物质的毒性和功效试验。

主权项

一种利用正常人多种皮肤细胞筛查皮肤抗氧化剂安全和功效的方法，其特征是含以下步骤：(1)正常人原代细胞的分离、培养和鉴定以离体包皮为原料，经分离、培养和鉴定，获得正常人皮肤原代细胞；(2)受试物的毒性检验将受试物配置一组具有浓度梯度的溶液，当正常人皮肤原代细胞的细胞密度长至80%～90%时，在多个正常人皮肤原代细胞中分别加入上述具有浓度梯度的受试物形成受试物组，同时设立阳性对照组、阴性对照组和空白对照组，在各组中分别加入MTT和DMSO溶液，用酶标法分别测各组的吸光度，并根据下述公式，计算细胞活性抑制率，细胞活性抑制率=[1－(受试物吸光度值－空白吸光度值)÷（阴性对照吸光度值－空白吸光度值）]×100%，根据细胞活性抑制率曲线，计算出皮肤抗氧化剂的20%抑制浓度（IC20）、半数致死抑制浓度（IC50）、70%抑制浓度（IC70），抗氧化剂的毒性判断过程如下：（一）经口毒性预测：根据下述公式预测急性经口毒性试验的LD50，log(LD50[mmol/kg])=0.435×log(IC50[mmol/L])+0.625，如LD50＞5000mg/kg，预测该受试物实际无毒，可用于食品、药品抗氧化的进一步研究，如LD50＜500mg/kg，预测该受试物中等毒性，不适宜进一步开发，如500mg/kg＜LD50且＜5000mg/kg，预测该受试物可能微毒性，建议在该受试物的安全剂量范围内进行下一步研究；（二）细胞毒性判定：选择受试物的可溶解最大浓度测试，如细胞活性抑制率IC＜30%时，表明在此浓度下该受试物可认为无细胞毒性，该受试物可用于皮肤抗氧化剂功效的进一步测试；(3)受试物的配制及受试物浓度的确定将受试物配制一组具有浓度梯度的溶液；当正常人原代细胞的细胞密度长至80%时，将该组具有浓度梯度的受试物，分别加入多个正常人原代细胞中形成受试物组，并分别设置阳性对照、空白对照以及阴性对照，按照MTT法，测试细胞的活性，用酶标法测试各组的吸光度，按照公式：细胞活性=（受试物吸光度值—空白对照吸光度值）/（阴性对照吸光度值—空白对照吸光度值），皮肤抗氧化功效的研究需要在外界因素造成皮肤细胞氧化损伤后的情况下进行，其中外界因素包括紫外线照射或化学试剂损伤，应选取细胞活性＞90%的受试物浓度为最高试验浓度；(4)紫外线诱导辐射剂量的确定正常人原代细胞的细胞密度长至80%时，设置具有梯度的UVA及UVB辐照量，按 具有梯度的UVA及UVB辐照量分别照射多个正常人原代细胞形成正常人原代细胞组，并设置空白对照和阴性对照，利用酶标仪分别测试正常人原代细胞组、空白对照以及阴性对照的吸光度，根据公式：细胞活性=（紫外线照射正常人原代细胞组吸光度值—空白对照吸光度值）/（阴性对照吸光度值—空白对照吸光度值），选取细胞活性在70%的辐照剂量进行抗氧化效果试验；(5)受试物抗氧化效果的确认根据步骤(3)确定的受试物浓度和步骤(4)中确定的UVA及UVB辐照剂量，待正常人原代细胞长至80%时，分别设立未辐照组、辐照后加受试物组以及辐照后不加受试物组，以正常人原代皮肤细胞经紫外线照射后添加维生素C为阳性对照，测试各组的细胞凋亡、细胞周期、ROS水平以及SOD水平，并根据测试结果，判断各皮肤抗氧化剂的抗氧化效果。