[发明专利]抗氨基甲酸肟酯类农药丁酮威单克隆抗体的制备方法

摘要

本发明涉及氨基甲酸肟脂类农药丁酮威单克隆抗体的制备方法，属于生物技术领域。专用于特异性识别氨基甲酸肟脂类农药丁酮威单克隆抗体的制备，及其在农产品和农业生产环境中丁酮威残留的高灵敏快速检测。丁酮威半抗原与载体蛋白通过活泼酯法偶联形成完全抗原，用该完全抗原免疫Balb/C鼠，脾细胞和Sp2/0骨髓瘤细胞通过杂交瘤技术制备杂交瘤细胞，获得了稳定分泌抗丁酮威的单克隆抗体。本发明抗体的制备技术可行：抗原的整个制备过程不需要特别的仪器设备，易于规模化生产。

主权项

1.丁酮威单克隆抗体的制备方法，包括： 半抗原制备：1.1H1的合成 1g丙醛肟和1.88g丁二酸酐在20ml THF(无水)N2环境中加入三乙胺2.15ml，加热回流24h，酸化后乙酸乙酯萃取得2.6g产物，用乙酸乙酯和石油醚1∶1加热溶解，乘热过滤然后重结晶，得1.74g产物。1H NMR(300MH，CDCl3)δ：2.97(s，3H)，3.11(s，3H)，4.00(s，4H)。 1.2H2的合成 2.95g三光气和8m1吡啶一起溶于20m1二氯甲烷中，用20m1二氯甲烷溶解3.3mmol丙酮肟，在-15℃条件下，缓慢将此溶液滴加于三光气和吡啶的混合液中，滴加后缓慢升至室温，反应5h，过滤，用冷水洗三遍，用无水Na2S04干燥。 称取产物酰氯3.275g(约12.1mmo1)，溶入4ml1，4-二氧六环，置5℃冰箱冷却，得A液；称取β-丙胺酸1.989g(约22.3mmo1)，溶进4ml4mol/L NaOH溶液，置5℃冰箱冷却，得B液；另取3ml 4mol/L NaOH溶液，置5℃冰箱冷却，得C液。将A液与C液均分成5等份，每间隔5分钟向B液中同时各加入1份，整个反应置冰水中，磁力搅拌下进行。加样全部完成开始记时，2小时后结束反应。用浓盐酸调节反应终液的pH值为4，目标产物用乙酸乙酯(50mL×3)萃取；乙酸乙酯相用稀HCl洗涤数次，用1mol/LNaHCO3溶液(50mL ×2)萃取；水相再用浓盐酸酸化，乙酸乙酯再萃取；无水Na2SO4干燥，所得物减压蒸馏浓缩至13.8ml，向浓缩液中逐渐加入31ml正己烷，白色结晶物析出，过滤。结晶物经低温干燥得3.898g；再经过甲苯与去离子水5℃下洗涤，低温干燥后称重得到Hapten1较纯品1.871g，产率为48％。1H NMR(300MHz，DMSO)δ：2.22(2H，t，J＝7.2Hz)，1.67(m，2H)，3.07(m，2H)，1.98(s，3H)，1.97(s，3H)。 1.3H3的合成 1.3.13-甲巯基-2-丁酮肟① 3-甲巯基-2-丁酮(0.2g，1.69mmo1)溶于2ml的吡啶中，加入盐酸羟胺(0.36g，5.13mmo1)，搅拌24h。停止反应，冰浴下用3mol/L盐酸调节pH值，用乙酸乙酯萃取(10ml×3)，无水硫酸钠干燥，过滤，旋干。得无色油状物①(0.2，88.9％)。1H NMR(300MHz，CDCl3)δ：3.43(m，2H)，1.97(s，3H)，1.93(s，3H)，1.36(d，3H，J＝7.2Hz)。 1.3.20-[N-(2-乙氧基-2-氧代乙基)氨甲酰]-3-甲巯基丁酮肟(② 产物①(0.2g，1.50mrno1)与0.1ml三乙胺溶于I0ml的二氯甲烷中，向其中滴加异氰酰乙酸乙酯(0.2g，1.55mmo1)与4ml的二氯甲烷的混合溶液。常温下搅拌1h，然后升温至40-45℃再反应1h。冷却，用水洗涤(20ml x3)。有机层用无水硫酸钠干燥，过滤，浓缩得白色油状物②(0.20g，50.9％)。1H NMR(300MHz，CDCl3)δ：4.14(m，2H)，3.97(m，2H)，3.41(m，1H)，1.98(s，3H)，1.91(s，3H)，1.32(d，3H，J＝6.9Hz)，1.20(t，3H，J＝6.9Hz)。 1.3.30-(N-乙酸氨甲酰)-3-甲巯基丁酮肟H3 产物②(0.20g，0.76mmol)加入到碳酸钠的水溶液中(0.58g碳酸钠，18ml水)，加入甲醇至原料溶解。在55℃下搅拌半个小时。冷却至常温，将有机相旋干。水层用3mol/L盐酸调节pH至3-4。乙酸乙酯萃取(20ml×3)，无水硫酸钠干燥，过滤，浓缩得粗产物。经柱色谱分离[洗脱剂：乙酸乙酯∶石油醚(1∶2，v/v)]，得淡黄色油状物H3(0.16g，89.9％)。1H NMR(300MHz，CDCl3)δ：4.11(d，2H，J＝5.1Hz)，3.48(m，1H)，2.06(s，3H)，1.97(s，3H)，1.38(d，3H，J＝6.9Hz)。 1.4H4的合成 1.4.13-甲巯基-2-丁酮肟③ 3-甲巯基-2-丁酮(0.2g，1.69mmo1)溶于2ml的吡啶中，加入盐酸羟胺(0.36g，5.13mmo1)，搅拌24h。停止反应，冰浴下用3mol/L盐酸调节pH值，用乙酸乙酯萃取(10ml×3)，无水硫酸钠干燥，过滤，旋干。得无色油状物③(0.2g，85.9％)。1H NMR(300MHz，CDCl3)δ：3.43(m，1H)，1.97(s，3H)，1.93(s，3H)，1.36(d，3H，J＝7.2Hz)。 1.4.20-[N-(4-氧代丁酸)]-3-甲巯基丁酮肟H4 产物③(0.2g，1.50mmo1)，丁二酸酐(0.15g，1.50mmo1)溶于5ml的四氢呋喃中，加入1m1三乙胺为催化剂。常温搅拌24h。反应结束后，旋干溶剂，加乙酸乙酯稀释，用3mol/L盐酸调节pH值至3-4。用乙酸乙酯萃取(10ml×3)，无水硫酸钠干燥，过滤，旋干。经柱色谱分离[洗脱剂：乙酸乙酯∶石油醚(1∶2，v/v)〕，得淡黄色油状物H4(0.2g，57.3％)。1H NMR(300MHz，CDCl3)δ：3.60(m，1H)，2.75(s，4H)，2.02(s，3H)，2.00(s，3H)，1.38(d， 3H，J＝7.2Hz)。 1.5H5的合成 1.5.13-[(1-甲基-2-氧代丙基)]巯基丙酸甲酯④ 3-氯-2-丁酮(1.06g，10mmo1)，3-巯基丙酸甲酯(1.22g，10mmo1)，溶于11ml二氯甲烷中，加入1ml三乙胺。冰浴搅拌30min，撤去冰浴，常温下搅拌过夜，过程中一直有不溶物。反应结束后，加入2.5ml水，不溶物溶解。分液，取有机层。再用水10ml萃取一次。取有机层，无水硫酸钠干燥，过滤，浓缩得粗产物。经色谱柱分离[洗脱剂：乙酸乙酯∶石油醚(1∶4，v/v)]，得无色油状物④(0.68g，35.8％)。1H NMR(300MHz，CDCl3)δ：3.70(s，3H)，3.55(m，1H)，2.72(m，2H)，2.59(m，2H)，2.29(s，3H)，1.40(d，3H，J＝3.9Hz)。 1.5.23-1(1-甲基-2-异亚硝基丙基)]巯基丙酸甲酯⑤ 产物④(0.68g，3.58mmo1)，溶于3.5ml的吡啶中，加入盐酸羟胺(0.74g，10.7mmo1)搅拌24h。停止反应，冰浴下用3mol/L盐酸调节pH值，用乙酸乙酯萃取(10ml×3)，无水硫酸钠干燥，过滤，旋干。得无色油状物⑤(0.57g，78％)。1H NMR(300MHz，CDCl3)δ：3.69(s，3H)，3.60(m，1H)，2.71(m，2H)，2.60(m，2H)，1.93(s，3H)，1.35(d，3H，J＝7.2Hz)。 1.5.30-(N-乙基氨甲酰)-3-(3-甲氧基-3-氧代丙基)巯基丁酮肟⑥ 产物⑤(0.57g，2.78mmol)，异氰酸乙酯(0.21g，3.02mmol)溶于5ml乙醚中，加入3ml三乙胺，搅拌12h。反应结束后，用水∶乙醚(20ml∶10ml)萃取反应液，水层再用乙酸乙 酯(20mlx2)洗涤，有机层用无水硫酸钠干燥，过滤，浓缩得粗产物。经柱色谱分离[洗脱剂：乙酸乙酯∶石油醚(1∶5，v/v)]，得无色油状物⑥(0.51g，67.1％)。1H NMR(300MHz，CDCl3)δ：3.69(s，3H)，3.60(m，1H)，3.34(m，2H)，2.71(m，2H)，2.68(m，2H)，2.05(s，3H)，1.38(d，3H，J＝7.2Hz)，1.21(t3H，J＝7.2Hz)。 1.5.40-(N-乙基氨甲酰)-3-(2-羧乙基)巯基丁酮肟H5 产物⑥(0.51g，1.84mmol)加入到碳酸钠的水溶液中(1.43g碳酸钠，36ml水)，加入甲醇至原料溶解。在75℃下搅拌一个小时。冷却至常温，将有机相旋干。水层用3mol/L盐酸调节pH至3-4。乙酸乙酯萃取(20mlx3)，无水硫酸钠干燥，过滤，浓缩得粗产品。经色谱柱分离[洗脱剂：乙酸乙酯∶石油醚(1∶2，v/v)]，得淡黄色油状物H5(0.28g，58.1％)。1H NMR(300MHz，CDCl3)δ：3.63(m，1H)，(m，2H)，2.66(m，4H)，2.06(s，3H)，1.38(d，3H，J＝7.2Hz)，1.20(t，3H，J＝7.2Hz)。 抗原制备：免疫抗原的制备：称取半抗原0.25mmol和0.25mmol NHS，用1.5ml DMF溶液溶解。称取0.25mmol DCC溶解于1ml DMF中，将此溶液缓慢加入上述半抗原和NHS的溶液中。在磁力搅拌下室温密封反应7小时。反应终液置4℃冰箱冷却2小时以上，经12000rpm离心5分钟，取上清活泼酯液十分缓慢的加入到3ml15mg/ml的BSA蛋白中，反应在磁力搅拌下室温搅拌4小时。待反应完成后，将反应液置于透析袋内，于0.2mol/LpH6.8的PB缓冲液中4℃搅拌透析，每四小时换一次透析液，共透析60小时。透析结束后将透析袋中的白色乳浊液(HA-BSA)取出分装保存于-20℃冰箱中。 包被抗原的合成：方法同免疫抗原的偶联，即得H-OVA。 小鼠免疫：将制备好的H3-BSA作为免疫原免疫6-8周龄雌性Balb/C鼠，每次每只小鼠的免疫原用 量200μg，共免疫五次，第一次免疫采用由等体积的免疫原和弗氏完全佐剂乳化，腹腔注射。和第一次免疫间隔三周后，第二次至第五次每次免疫间隔2周，采用等体积的免疫原和弗氏不完全佐剂乳化； 从第三次开始，每次免疫后一周，鼠尾静脉采血用间接非竞争ELISA法检测血清抗体的特异性：以空白对照调零；以未经免疫小鼠血清作为阴性对照，若待测孔0D450值大于或等于2.1倍阴性孔值定为阳性。 细胞融合通过阳性值筛选Balb/C鼠，阳性值高的Balb/C鼠直接用dH1-BSA免疫，三天后取脾脏，脾细胞和对数生长期的Sp2/0骨髓瘤细胞通过杂交瘤技术制备杂交瘤细胞，37℃，5％二氧化碳培养箱培养10-12天后，通过检测融合孔上清筛选杂交瘤细胞； 杂交瘤筛选：用1000倍稀释的包被原H3-OVA包被酶标板，1％明胶封闭，取杂交瘤细胞的培养上清，采用非竞争间接ELISA法初步进行筛选(方法如上所述，其中一抗为杂交瘤细胞上清，以免疫小鼠的血清为阳性对照，以骨髓瘤细胞上清为阴性对照)，选取呈阳性的细胞孔，细胞上清留存用于下一步检测，呈阴性的孔若重复一次后仍为阴性则可舍弃。 对于上一步呈阳性的细胞孔则采用间接竞争ELISA法进行进一步的确认，对农药丁酮威出现明显的竞争性抑制反应的孔即为产生抗氨基甲酸肟脂类农药丁酮威抗体的阳性孔，阳性孔通过有限稀释法进行亚克隆，阳性孔分泌的上清即为所制备的丁酮威单克隆抗体。 产生权利要求所述的杂交瘤细胞株1C9D8于2012年12月25日保藏于中国典型培养物保藏中心(中国，武汉，武汉大学，邮编430072)，保藏编号为CCTCC NO：C2012190。