[发明专利]抗氨基甲酸肟酯类农药丁酮威单克隆抗体的制备方法

说明书

(一)技术领域

本发明是氨基甲酸肟酯类农药丁酮威单克隆抗体的制备，属于生物技术领域。专用于特异性识别氨基甲酸肟脂类农药丁酮威的单克隆抗体制备，以及农产品和农业生产环境中丁酮威残留的高灵敏快速检测，特别适用于大批量样品检测和现场监测。 

(二)背景技术

随着科学技术的进步，农药已成为防治病虫害的主要手段，对农业稳产、增产起着举足轻重的作用。自上世纪70年代以来，由于有机氯农药受到限用或禁用，同时伴着抗有机磷杀虫剂的昆虫品种日益增多，使得氨基甲酸酯类农药的用量逐年增加。目前氨基甲酸酯类农药已成为我国使用量较大的农药品种之一，被广泛应用于粮食、蔬菜、水果等经济作物上的害虫防治，主要产品有混灭威、甲萘威、涕灭威、克百威、速灭威、仲丁威、丁酮威等。虽然这类农药具有杀虫谱广、药效快等优点，但随着氨基甲酸酯类农药的用量逐年增加，它对人与环境的负面影响也越来越大，这就使得氨基甲酸酯类农药残留分析检测受到越来越多的关注。 

目前，氨基甲酸酯类农药的残留检测多采用薄层色谱法、气相色谱法、高效液相色谱法等方法。这些方法的检测限低、灵敏度高，已有相关的技术标准可供参考，但由于需要昂贵的仪器、专门的操作人员，以及样品前处理复杂、成本高、时间长，因此不能更好地满足快速简便的现场检测要求。 

氨基甲酸酯类的免疫检测方法具有快速、廉价、简便、特异的优点，可便携而进行现场监测。克服了传统检测方法的缺点。通过化学合成氨基甲酸肟酯类农药的半抗原，与载体蛋白偶联获得完全抗原，制备针对环境和农产品中氨基甲酸肟脂类农药丁酮威特异性的单克隆抗体。建立丁酮威免疫学检测方法，该方法的完成，将解决半抗原合成、偶联、单克隆抗体制备等关键技术，建立丁酮威的免疫学快速检测技术。该专利不仅为食品安全检测，而且为我国农产品等的出入境检测。环境监测部门的水域监测提供了一种新的技术手段和检测方法。对我国农产品的可持续健康发展、解决食品安全问题具有重要的现实意义和重要的社会、经济价值。丁酮威的免疫学检测技术在国际国内上尚属空白，目前尚未见该类方法的研究报道。 

(三)发明内容

本发明的目的是提供丁酮威单克隆抗体的制备方法，通过化学合成丁酮威的人工半抗原，制备完全抗原，免疫Balb/C鼠，通过杂交瘤技术制备特异性强的丁酮威单克隆抗体，并用于农产品和农业生产环境中丁酮威残留的高灵敏快速检测。 

(四)技术方案 

丁酮威单克隆抗体的制备方法，包括： 

1.半抗原制备： 

1.1H1的合成 

1g丙醛肟和1.88g丁二酸酐在20ml THF(无水)N2环境中加入三乙胺2.15ml，加热回流24h，酸化后乙酸乙酯萃取得2.6g产物，用乙酸乙酯和石油醚1∶1加热溶解，乘热过滤然后重结晶，得1.74g产物。1HNMR(300MH，CDC13)δ：2.97(s，3H)，3.11(s，3H)，4.00(s，4H)。 

1.2H2的合成 

2.95g三光气和8ml吡啶一起溶于20ml二氯甲烷中，用20ml二氯甲烷溶解3.3mmol丙酮肟，在-15℃条件下，缓慢将此溶液滴加于三光气和吡啶的混合液中，滴加后缓慢升至室温，反应5h，过滤，用冷水洗三遍，用无水Na2SO4干燥。 

称取产物酰氯3.275g(约12.1mmo1)，溶入4m11，4-二氧六环，置5℃冰箱冷却，得A液；称取β-丙胺酸1.989g(约22.3mmol)，溶进4ml4mol/LNaOH溶液，置5℃冰箱冷却，得B液；另取3ml4mol/L NaOH溶液，置5℃冰箱冷却，得C液。将A液与C液均分成5等份，每间隔5分钟向B液中同时各加入1份，整个反应置冰水中，磁力搅拌下进行。加样全部完成开始记时，2小时后结束反应。用浓盐酸调节反应终液的pH值为4，目标产物用乙酸乙酯(50mL×3)萃取；乙酸乙酯相用稀HCl洗涤数次，用1mol/LNaHCO3溶液(50mL×2) 萃取；水相再用浓盐酸酸化，乙酸乙酯再萃取；无水Na2SO4干燥，所得物减压蒸馏浓缩至13.8ml，向浓缩液中逐渐加入31ml正己烷，白色结晶物析出，过滤。结晶物经低温干燥得3.898g；再经过甲苯与去离子水5℃下洗涤，低温干燥后称重得到Hapten1较纯品1.871g，产率为48％。1H NMR(300MHz，DMSO)δ：2.22(2H，t，J＝7.2Hz)，1.67(m，2H)，3.07(m，2H)，1.98(s，3H)，1.97(s，3H)。 

1.3H3的合成 

1.3.13-甲巯基-2-丁酮肟①