[发明专利]一种检测酵母老化的方法

摘要

本发明提供一种检测酵母老化的方法，首先对酵母菌体进行传代培养，得到不同代数的酵母细胞发酵液，将酵母发酵培养液通过离心分离得到酵母细胞，酵母细胞经冷冻干燥后，称取一定量冻干的细胞用破壁缓冲液溶解，超声破碎，破碎后的酵母细胞冷冻离心，取上清液测定SOD活性以及超氧阴离子自由基O2-.生成速率和含量，分析三者之间的相互关系，建立SOD活性与超氧阴离子自由基含量和产生速率之间的标准关系曲线，进而根据标准曲线，已知SOD活性，查到酵母的代数。

主权项

一种检测酵母老化的方法，其特征在于对酵母菌体进行传代培养，得到不同代数的酵母细胞发酵液，将酵母发酵培养液通过离心分离得到酵母细胞，酵母细胞经冷冻干燥后，称取一定量冻干的细胞用破壁缓冲液溶解，超声破碎，破碎后的酵母细胞冷冻离心，取上清液测定SOD活性以及超氧阴离子自由基生成速率和含量；具体的操作步骤如下：第一步、培养酵母细胞，其中：1)培养基：磷酸氢二钾10.5g，磷酸二氢钾4.5g，硫酸铵1g，柠檬酸三钠0.5g，葡萄糖60g，无氨基酵母氮源培养基6.7g，组氨酸10mg，甲硫氨酸20mg，色氨酸20mg，1000ml去离子水；2)培养条件：按照3～8×106cfu/mL的接种量接种，在28～30℃，150～180r/min条件下培养到发酵终点，发酵结束；3)从固体斜面培养基上的菌种转接到液体培养基定义为第一代酵母，到达发酵终点后，以5.05×106cfu/mL的接种量转接一次，进行传代；4）收集细胞：发酵液在4000r/min条件下离心20分钟，用无菌水清洗3～5次，每次4000r/min，离心10分钟，得到干净的酵母细胞，通过冷冻干燥（‑48℃,4Pa），得到冻干的酵母，备用；其中所述的发酵终点为培养基中的残糖含量在1～3mg/mL时；第二步、对酵母细胞采用反复冻融超声破壁，称取2g冻干的酵母，用30ml的破壁缓冲液溶解，在‑20℃下冷冻4h，于30℃下溶解0.5h，反复两次，进行超声破碎，超声破碎时工作2s，间歇3s，全程时间25min，功率400w，保护温度4℃，破碎后的混合液冷冻离心，离心速率10000r/min，离心时间10min，保护温度4℃，取上清液，立即进行测定；其中，破壁缓冲液配方是每1000ml中含有：50mmol/L的Tris‑HCl，1.491gKCl，0.146gEDTA；第三步、采用邻苯三酚自养化的方法和羟胺氧化法测定细胞提取液中SOD活性以及超氧阴离子自由基生成速率和含量，分析三者之间的相互关系，建立SOD活性与超氧阴离子自由基含量和产生速率之间的标准关系曲线，进而根据标准曲线，已知SOD活性，查到酵母的代数。