[发明专利]一种定向克隆方法及载体的改造方法及T载体

摘要

本发明公开了一种定向克隆方法及载体的改造方法及T载体，所述定向克隆的方法包括：设计并合成酶切盒、构建T载体、形成两端带有突出的dT的线性化的T载体、生成目标基因PCR片段、构建含有目标基因的重组载体。本发明定向TA克隆技术可用作制备高效的定向克隆的T载体，在分子生物学实验中广泛应用于PCR产物的克隆和表达。由于本发明改造的是表达载体，PCR产物可直接连接该载体，经单酶切鉴定后确定目的基因的连接方向，即可转入细胞内进行表达，而无需通过传统的测序等繁琐步骤才能确定连接方向，以简单快捷的方法实现定向克隆，一步构建出工程菌，应用前景广阔。

主权项

一种定向克隆的方法，其特征在于，具体包括以下步骤：设计并合成酶切盒：所述酶切盒的两端带有Xcm I内切酶酶切位点，并在所述酶切盒的两端分别添加其他酶切位点；构建T载体：将所述酶切盒构建到载体上，得到带有两个Xcm I内切酶酶切位点的T载体；形成两端带有突出的dT的线性化的T载体：采用Xcm I内切酶对所述第二表达载体进行单酶切，形成两端带有突出的dT的线性化的T载体；生成目标基因PCR片段：将目标基因片段用PCR扩增方法在5’或3’端加入一个与T载体的3’或5’端所对应相同的限制性内切酶位点，得到目标基因PCR片段，所述所对应相同的限制性内切酶位点在目标PCR片段中与T载体中均有且仅有一个；构建含有目标基因的重组载体：用T4连接酶把目标基因PCR片段与T载体连接起来构成含有目标基因的重组载体。