[发明专利]一种定向克隆方法及载体的改造方法及T载体

权利要求书

1.一种定向克隆的方法，其特征在于，具体包括以下步骤：

设计并合成酶切盒：所述酶切盒的两端带有Xcm I内切酶酶切位点，并在所述酶切盒的两端分别添加其他酶切位点；

构建T载体：将所述酶切盒构建到载体上，得到带有两个Xcm I内切酶酶切位点的T载体；

形成两端带有突出的dT的线性化的T载体：采用Xcm I内切酶对所述第二表达载体进行单酶切，形成两端带有突出的dT的线性化的T载体；

生成目标基因PCR片段：将目标基因片段用PCR扩增方法在5’或3’端加入一个与T载体的3’或5’端所对应相同的限制性内切酶位点，得到目标基因PCR片段，所述所对应相同的限制性内切酶位点在目标PCR片段中与T载体中均有且仅有一个；

构建含有目标基因的重组载体：用T4连接酶把目标基因PCR片段与T载体连接起来构成含有目标基因的重组载体。

2.根据权利要求1所述的定向克隆的方法，其特征在于，所述定向克隆的方法还包括以下步骤：

转化和鉴定：将所述含有目标基因的重组载体转入大肠杆菌感受态细胞中，通过涂抗性平板得到单克隆菌落，挑取单克隆菌落进行扩大培养，然后提取质粒，再用限制性内切酶进行单酶切鉴定，确定目标基因的连接方向；

其中，转化和鉴定步骤中所述的限制性内切酶为生成目标基因PCR片段步骤中所述的限制性内切酶位点所对应的限制性内切酶。

3.根据权利要求1所述的定向克隆的方法，其特征在于，所述设计并合成酶切盒步骤，包括以下步骤：

合成标记基因，所述标记基因用于鉴定和筛选所述酶切盒是否成功地扩增出所述酶切盒；

在所述标记基因的两端添加多个酶切位点，其中，所述标记基因的两端均添加有一Xcm I内切酶酶切位点；

通过PCR扩增所述酶切盒片段。

4.根据权利要求1所述的定向克隆的方法，其特征在于，所述构建T载体步骤中，包括以下步骤：

将所述酶切盒片段与pMD-19T载体相连，得到带有所述酶切盒的第一重组载体；

将所述第一重组载体转化到感受态细胞中，培养后挑取单菌落，进行扩大培养，从菌液中提取所述第一重组载体；

对载体和所述第一重组载体分别用同样的限制性内切酶进行双酶切；

回收所述第一重组载体切出的酶切盒片段和酶切后的载体；

将所述重组载体切出的酶切盒片段和酶切后的载体进行连接，形成第二重组载体；

将第二重组载体转化至感受态细胞，培养后挑取单菌落，进行扩大培养，从菌液中提取所述第二重组载体；

对所述第二重组载体用上述同样的限制性内切酶进行酶切鉴定，经鉴定正确后，得到带有两个Xcm I内切酶酶切位点的T载体。

5.一种载体的改造方法，其特征在于，包括以下步骤：

设计并合成酶切盒：所述酶切盒的两端带有Xcm I内切酶酶切位点，并在所述酶切盒的两端分别添加其他酶切位点；

构建T载体：将所述酶切盒构建到载体上，得到带有两个Xcm I内切酶酶切位点的T载体；

所述载体为待改造的载体，所述载体为克隆型载体或表达型载体。

6.根据权利要求5所述的载体的改造方法，其特征在于，所述设计并合成酶切盒步骤，包括以下步骤：

合成标记基因，所述标记基因用于鉴定和筛选所述酶切盒是否成功地扩增出所述酶切盒；

在所述标记基因的两端添加多个酶切位点，其中，所述标记基因的两端均添加有一Xcm I内切酶酶切位点；

通过PCR扩增所述酶切盒片段。