[发明专利]一种定向克隆方法及载体的改造方法及T载体

说明书

技术领域

本发明涉及生物工程领域，尤其涉及一种定向克隆方法及载体的改造方法及T载体。

背景技术

PCR是目前体外基因扩增最常用的方法，对PCR产物进行快速有效的克隆，是开展基因保存、扩增，测序以及表达的有效方法。为此，国内外许多学者探索了很多不同的克隆方法。常用的方法有非定向克隆和定向克隆，这两种方法都建立了相应载体，不过这些现有的克隆载体虽然都能够达到克隆的目的，但是也各有一定的不足之处。

T载体快速高效克隆PCR产物的明显优势显示了其在构建各种基因文库中的应用前景，由于载体3’端各有一个突出的3’dT残基，恰好可与PCR产物末端由于Taq DNA聚合酶非模板依赖的末端转移酶活性而添加的dA(脱氧腺苷)互补配对，这种以粘性互补配对连接到载体上，称为T-A克隆，具有操作简单、快速高效、阳性克隆比例高等优点，从而大大提高PCR产物的连接效率。然而，T载体也有一定的不足之处，由于载体与PCR产物两端均是T-A连接，因此PCR产物可能正向连接或反向连接载体，无法实现定向克隆，需经送样测序后方可知产物与载体连接方向。目前商业化的T载体如pMD-18T，pGEM-T等均是是克隆型载体，仅能克隆扩增DNA片段，测序等功能，不能用于表达蛋白，另外还存在载体易发生自连，阳性克隆难以筛选等问题。

T载体按照功能可分为克隆型T载体与表达型T载体，目前市场上供应的T载体主要是克隆型T载体，具有克隆目的基因的功能，仅满足扩增和测序的需要。若要表达目的基因，还需要将目的基因重组至表达载体中。表达型T载体同时满足基因克隆和表达的需要，可直接连接目的基因进行蛋白质表达分析，操作简便，避免过多操作步骤影响目的基因的序列。但是制备高效表达型T载体有很多难点。克隆型T载体无需顾及目的DNA片段的连接方向，只需有复制起点、筛选标记即可，而表达型T载体除了上述要素外，还需要转录／翻译的必要元件-启动子，终止子等，另外必须顾及上下游的表达调控元件，它们均需要严格的方向次序排列。由于表达型T载体与目的基因PCR片段连接两端仍然是是同样的T-A连接，同样目的基因PCR片段与载体可发生正向或反向连接的情况，不能以确定的方式连接，基因表达要求目的基因必需以正确的方向连接方可表达出目的蛋白，所以，基因PCR片段与载体连接后必需先转入细胞，挑取一批单克隆菌株进行培养，表达前必须送样测序，等待测序结果时间较长，不仅拖延实验的进度，而且耗费大量的人力物力，需要从众多测序结果中经过序列比对确认目的基因的连接方向，方能进行表达，这大大增加了研究开发的困难。由于上述的问题限制了表达型T载体应用范围，目前市面上仅有少数的几种表达型T载在售，并且因为上述各种原因导致极少人愿意采用。

因此，现有技术有待于完善和发展。

发明内容

鉴于上述现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种定向克隆方法及载体的改造方法及T载体，利用可变限制性内切酶Xcm I制备出可进行高效快捷的能定向克隆T载体，旨在解决现有T载体不能进行定向克隆的问题。

为了解决上述技术问题，本发明的技术方案如下：

在本发明中，提供一种定向克隆的方法，是一种T-A定向克隆方法，其具体包括以下步骤：

设计并合成酶切盒：所述酶切盒的两端带有Xcm I内切酶酶切位点，并在所述酶切盒的两端分别添加其他酶切位点；

构建T载体：将所述酶切盒构建到载体上，得到带有两个Xcm I内切酶酶切位点的T载体；

形成两端带有突出的dT的线性化的T载体：采用Xcm I内切酶对所述第二表达载体进行单酶切，形成两端带有突出的dT的线性化的T载体；

生成目标基因PCR片段：将目标基因片段用PCR扩增方法在5’或3’端加入一个与T载体的3’或5’端所对应相同的限制性内切酶位点，得到目标基因PCR片段，所述所对应相同的限制性内切酶位点在目标PCR片段中与T载体中均有且仅有一个；

构建含有目标基因的重组载体：用T4连接酶把目标基因PCR片段与T载体连接起来构成含有目标基因的重组载体。

所述定向克隆的方法，还包括以下步骤：

转化和鉴定：将所述含有目标基因的重组载体转入大肠杆菌感受态细胞中，通过涂抗性平板得到单克隆菌落，挑取单克隆菌落进行扩大培养，然后提取质粒，再用限制性内切酶进行单酶切鉴定，确定目标基因的连接方向；

其中，转化和鉴定步骤中所述的限制性内切酶为生成目标基因PCR片段步骤中所述的限制性内切酶位点所对应的限制性内切酶。

具体地，所述设计并合成酶切盒步骤中，包括以下步骤：