[发明专利]利用电化学核酸适配体传感器一步快速检测赭曲霉毒素Ａ的方法

摘要

本发明涉及利用电化学核酸适配体传感器快速一步检测赭曲霉毒素Ａ的方法。所述方法的具体操作步骤如下：（1）裸金电极表面的抛光处理，（2）适配体电化学传感器的修饰；（3）对赭曲霉毒素A标准浓度溶液进行检测，建立标准曲线；（4）对含赭曲霉毒素A的实际样品溶液进行定量检测。本发明提高了检测赭曲霉毒素的灵敏性，最低可以检测出0.01pg/mL的赭曲霉毒素A；大大降低了检测目标毒素的成本，操作简单方便；仅需5～10min就可以实现一步检测出赭曲霉毒素A。

主权项

利用电化学核酸适配体传感器一步快速检测赭曲霉毒素Ａ的方法，其特征在于所述方法的具体操作步骤如下：（1）.裸金电极表面的抛光处理将裸金电极在浓度0.3 mmol/L的氧化铝粉末水溶液中打磨抛光处理5min，再在浓度0.05 mmol/L的氧化铝粉末水溶液中打磨抛光处理5 min，然后在无水乙醇溶液中超声清洗5 min，最后在去离子水中超声清洗5 min，彻底除去非特异性吸附在裸金电极表面的氧化铝粉末；（2）.适配体电化学传感器的修饰：取1mL浓度1 mmol/L 的三(β‑氯乙基)磷酸酯，加入到99 mL浓度为1mmol/L的赭曲霉毒素A核酸适配体溶液中，室温下活化孵育30 min，得到活化的赭曲霉毒素A核酸适配体溶液；取6 mL浓度1mmol/L活化的赭曲霉毒素A核酸适配体溶液，滴加在步骤（1）抛光处理后的裸金电极表面，温度30℃条件下孵育2h，得到赭曲霉毒素A核酸适配体修饰的电极；用去离子水清洗赭曲霉毒素A核酸适配体修饰的电极2～3次，得到清洗过的电极；将清洗过的电极浸没在200mL浓度2mmol/L 的6‑巯基己醇中，并在温度30℃条件下封闭4h，得到表面封闭过的电极，用去离子水清洗表面封闭过的电极，即得用于一步法检测赭曲霉毒素A的电化学核酸适配体传感器；赭曲霉毒素A核酸适配体为单链DNA探针，所述单链DNA探针的序列从5’端到3’端为GAT CGG GTG TGG GTG GCG TAA AGG GAG CAT CGG ACA，所述单链DNA探针的3’末端修饰了巯基，5’末端修饰了电化学活性物质亚甲基蓝；浓度为1mmol/L的赭曲霉毒素A核酸适配体溶液是3’末端修饰了巯基和5’末端修饰了亚甲基蓝的DNA适配体探针溶液；（3）.对赭曲霉毒素A标准浓度溶液进行检测，建立标准曲线：将电化学核酸适配体传感器作为工作电极，银/氯化银（Ag/AgCl）电极作为参比电极，铂丝电极作为对电极，置于10 mL浓度100 mmol/L 的Tris‑HCl缓冲液中，Tris‑HCl缓冲液的pH值为7.4，在Tris‑HCl缓冲液中加入浓度为1mg/L的赭曲霉毒素A标准溶液，得到含有赭曲霉毒素A浓度0.01pg/mL的溶液，置入所述工作电极，室温孵育反应5～10min；扫描方波伏安图谱，扫描高电位为0 V，低电位为‑0.4 V，频率50 Hz，电位增量为0.001 V，振幅为0.05 V，得到含有赭曲霉毒素A浓度为0.01pg/mL的氧化还原峰图谱及其氧化还原峰电流；同理，在含有赭曲霉毒素A浓度0.01pg/mL的溶液中接着加入浓度为1mg/L赭曲霉毒素A标准溶液分别得到含有赭曲霉毒素A的终浓度为0.1pg/mL的溶液A、含有赭曲霉毒素A的终浓度为1 pg/mL的溶液B、含有赭曲霉毒素A的终浓度为10 pg/mL的溶液C、含有赭曲霉毒素A的终浓度为100pg/mL的的溶液D，所述溶液A、溶液B、溶液C和溶液D为四种标准液；将工作电极分别依次置入四种标准液中，分别反应5～10min；分别扫描四种标准液的方波伏安图谱并记录相应的氧化还原峰电流值；以含有赭曲霉毒素A浓度0.01pg/mL的溶液和四种标准液对应的氧化还原峰峰电流值作为纵坐标，以含有0.01pg/mL的赭曲霉毒素A溶液的浓度和四种标准赭曲霉毒素A溶液的浓度作为横坐标，建立赭曲霉毒素一步法检测的标准曲线； （4）.对含赭曲霉毒素A的实际样品溶液进行定量检测：将作为工作电极的电化学核酸适配体传感器浸没在10 mL浓度为100 mmol/L 的Tris‑HCl缓冲液中，Tris‑HCl缓冲液的pH值为7.4，在Tris‑HCl缓冲液中加入含有未知浓度的赭曲霉毒素A溶液，反应5～10 min，扫描方波伏安图谱，扫描高电位为0 V, 低电位为‑0.4 V，频率50 Hz，电位增量为0.001V，振幅0.05 V；得到特定浓度赭曲霉毒素对应的氧化还原峰峰电流值，通过所述赭曲霉毒素一步法检测标准曲线，计算出所述未知浓度的赭曲霉毒素A溶液中赭曲霉毒素A的浓度。