[发明专利]云南番茄曲叶病毒基因组的分离鉴定及其农杆菌介导的侵染性克隆构建

摘要

本发明公开了一种云南番茄曲叶病毒基因组的分离鉴定及其农杆菌介导的侵染性克隆构建方法。提取感病番茄的基因组总DNA，PCR克隆病毒全基因组DNA，序列测定获得云南番茄曲叶病毒的全基因组序列。通过PCR和酶切的方法获得1.4个正向重复的基因组，并插入到具有高度复制能力的植物表达载体pBinPLUS，重组载体通过电击法导入具有强感染力的农杆菌菌株EHA105，从而获得以农杆菌介导的对寄主植物具有高效感染能力的侵染性克隆。本发明为云南番茄曲叶病毒田间检测、基因组结构与功能研究、寄主植物、传毒介体与病毒三者之间的互作研究提供了成熟的方法和体系。

主权项

一种双生病毒的新种云南番茄曲叶病毒基因组的分离鉴定方法，其特征在于包括如下步骤：1）从云南采集叶片卷曲、黄化、叶脉外突症状的番茄病叶，用CTAB方法提取番茄基因组总DNA；2）以番茄基因组总DNA为模板，根据双生病毒的保守序列设计简并引物1：5’‑TAATATTACCKGWKGVCCSC‑3’和简并引物2：5’‑TGGACYTTRCAWGGBCCTTCACA‑3’，PCR扩增病毒的部分序列，PCR扩增产物克隆至T‑Vector，对克隆产物进行阳性克隆的筛选及序列测定；3）根据测得的部分序列设计特异全长引物Y194F：5’‑ AATCATGGCCGCTCCTCAAAGC‑3’和Y194R：5’‑ GACATACGCGAATGCGGGAAC ‑3’，以番茄基因组总DNA为模板PCR扩增病毒的全基因组DNA，病毒全长PCR扩增产物克隆至T‑Vector，筛选阳性克隆并进行全序列测定；4）序列测定结果通过DNAStar分析软件进行组合、拼接，获得双生病毒的新种云南番茄曲叶病毒基因组DNA序列。