[发明专利]利用毕赤酵母表达系统生产猪圆环病毒2型衣壳蛋白颗粒样疫苗的方法

摘要

本发明提供了生产猪圆环病毒2型衣壳蛋白Cap颗粒样疫苗的方法，该方法以GenBank中PCV2-TJ毒株基因序列为模板，运用常规PCR方法扩增得到PCV-2衣壳蛋白Cap的成熟编码序列。将此基因与毕赤酵母分泌型表达载体pP-secSUMO3连接，构建pP-secSUMO3-Cap重组质粒，并用热激法转化大肠杆菌JM109进行扩增。阳性重组质粒经纯化处理后用BioRad公司电转仪电转化毕赤酵母菌株GS115。抗生素ZeocinTm浓度梯度筛选高拷贝菌株，分别提取这些高拷贝菌株的基因组DNA，以此为模板做PCR反应鉴定阳性克隆。通过仔猪攻毒试验，验证该颗粒样疫苗具有良好的免疫保护作用。

主权项

猪圆环病毒2型衣壳蛋白CAP颗粒样疫苗是通过以下方法制得的：(1)Cap蛋白基因的扩增以GenBank中PCV2‑TJ(序号AY181946)毒株基因序列为模板，用软件Primer5.0设计一对引物，在两条引物的5端分别加入FokI和SalI酶切位点：P1：5’CGTGGTCTCCAGGTATGACGTATCCAAGGAGGCGT3’P2：5’GGTCTCAGATCTTCAAGGGTTAAGTGGGGGGT3’以PCV‑2感染的PK15细胞培养物中提取的DNA产物为模板，应用PCR技术扩增出了实验室分离毒株PCV‑2的Cap蛋白全基因。该基因片段大小为722bp；(2)分泌型表达载体的构建、筛选、鉴定：通过设计的FokI/SalI双酶切位点，将目的基因Cap克隆入赤酵母分泌型表达载体pP‑secSUMO3中，转入大肠杆菌JM109，用PCR和双酶切方法鉴定得到重组菌株pP‑secSUMO3‑Cap。(3)Cap蛋白的表达：阳性重组质粒经纯化、线性化处理后用BioRad公司电转仪电转化毕赤酵母菌株GS115，Zeocin Tm浓度梯度筛选高拷贝菌株，挑取单克隆菌培养，SDS‑聚丙烯酰胺凝胶电泳筛选阳性表达菌。将重组阳性表达酵母菌上清经镍柱纯化分离后，加入SUMO蛋白酶2同步进行透析和标签切除，再次过镍柱纯化后，制得猪圆环病毒2型衣壳蛋白Cap。(4)利用纯化的猪圆环病毒2型衣壳蛋白，辅以佐剂，制备猪圆环病毒2型颗粒样疫苗。