[发明专利]利用毕赤酵母表达系统生产猪圆环病毒2型衣壳蛋白颗粒样疫苗的方法

说明书

技术领域

本发明提供了一种利用毕赤酵母表达系统生产猪圆环病毒2型(PCV-2)颗粒样疫苗的方法，属于生物技术领域，目的用于加强猪对猪II型圆环病毒的免疫保护作用及减少猪场的经济损失。

技术背景

猪圆环病毒2型(Porcine circovirusII，PCV-2)属于圆环病毒科(Circoviridae)圆环病毒属(circovirus)，PCV-2基因组全长1767bp或1768bp，共包含11个开放阅读框(ORF)，其中ORF1、Cap是两个最大的开放阅读框，分别编码复制相关蛋白(Rep蛋白)和衣壳蛋白(Cap蛋白)。Cap蛋白是主要的结构蛋白，具有很好的免疫原性，可以作为疫苗的候选蛋白。目前，国内外已有相关方面的大量报道，洛阳普莱柯已用家蚕生物反应器成功的表达出了PCV-2Cap蛋白，也有人成功的利用原核表达系统成功的表达出了PCV-2Cap蛋白。但因其生产成本高或蛋白免疫原性差等因素严重的影响了PCV-2Cap蛋白的大规模生产和应用。

发明内容

鉴于此，本发明的主要目的在于提供一种利用酵母表达系统生产猪圆环病毒2型颗粒样疫苗的方法，包括以下步骤：

(1)猪圆环病毒2型衣壳蛋白的Cap基因的扩增；

以GenBank中PCV2-TJ(序号AY181946)毒株基因序列为模板，用软件Primer5.0设计一对引物P1、P2，分别在P1、P2的5’端分别加入FokI和SalI酶切位点：

P1：5’CGTGGTCTCCAGGTATGACGTATCCAAGGAGGCGT3’

P2：5’GGTCTCAGATCTTCAAGGGTTAAGTGGGGGGT3’

以PCV-2感染的PK15细胞培养物中提取的DNA产物为模板，应用PCR技术扩增出了实验室分离毒株PCV-2的Cap蛋白全基因。该目的基因片段大小为722bp；

(2)以常规方法利用限制性内切酶FokI和SalI双酶切步骤(1)中PCR产物，实现与pP-secSUMO3酵母表达质粒的连接，构建重组Cap基因的酵母表达质粒，并命名为pP-secSUMO3-Cap；

(3)重组质粒pP-secSUMO3-Cap的扩增、提取：具体操作为，大肠杆菌JM109按常规活化后制备感受态，取pP-secSUMO3质粒DNA1μl，常规CaCl₂法转化JM109，将转化后的JM109菌液涂布于低盐LB平板中，20-22h后取单菌落，扩增，并以质粒抽提试剂盒(Promega公司)抽提获得质粒；

(4)以限制性内切酶SacI单酶切pP-secSUMO3-Cap，0.8％琼脂糖电泳回收完全线性化的质粒DNA，与酵母GS115的感受态菌液混合进行电转化；将转化后的菌株涂布于含不同浓度Zeocin的YPDS平板上，筛选出高拷贝菌株。

(5)利用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳筛选重组阳性表达酵母菌；

(6)取上述重组阳性表达酵母菌上清经镍柱纯化后，加入SUMO蛋白酶2同步进行透析和标签切除，再次过镍柱纯化，回收猪圆环病毒2型衣壳蛋白Cap，包装猪圆环病毒2型病毒样颗粒。

(7)利用纯化的猪圆环病毒2型病毒样颗粒，辅以佐剂ISA206，制备猪圆环病毒2型颗粒样疫苗

技术效果

本发明利用PCV-2感染的PK15细胞培养物中克隆的Cap基因，构建出一种新型的Cap蛋白分泌型酵母表达系统。本系统采用SUMO3为融合标签，一方面可以增强Cap蛋白可溶性和提高Cap蛋白表达量，另一方面可以正确有效地切割目的蛋白与融合标签，保证表达Cap蛋白的不含任何多余的氨基酸；本系统具有因子分泌信号肽，可使产物分泌出胞，有利于产品的纯化和生产。真核表达获得的蛋白的活性和免疫原性要远远高于原核表达的蛋白，利用本发明的真核表达系统表达的全长PCV2 Cap蛋白，具有表达量高的优点，并且可以形成病毒样颗粒。本发明真核表达系统生产PCV2 Cap蛋白的方法安全可靠，成本较低，适合大规模生产，为大量生产猪圆环2型特异性血清学检测抗原和猪圆环病毒2型疫苗的抗原成分蛋白Cap蛋白提供了基础。利用本系统生产的猪圆环病毒2型颗粒样疫苗可以诱导高水平的免疫抗体，并且可以提供良好的保护。

附图说明

图1PCV2 Cap基因PCR扩增结果注：M，DNA分子量标准；1，PCV2 ORF2基因的PCR产物；2，阴性对照。