[发明专利]一种玉米醇溶蛋白基因RNAi载体的构建方法

摘要

本发明公开了一种玉米醇溶蛋白基因RNAi载体的构建方法。该方法以pUC19为骨架载体，构建插入正向目的片段和胚乳特异性表达启动子P-zp22/6的重组载体，构建插入反向目的片段和终止子poly(A)的重组载体，将两重组载体分别酶切、连接得到重组载体pUC19-p22/6-22KD1-22KD2-poly(A)；再将GUS基因内含子插入到该重组载体，得到玉米醇溶蛋白基因RNAi载体，目的片段是22-KD醇溶蛋白基因部分cDNA片段。用相同方法构建了另一个玉米醇溶蛋白基因RNAi载体，目的片段为19-KD醇溶蛋白基因部分cDNA片段。该方法缩短了载体构建的时间，能成功获得高赖氨酸含量的转基因植株。

主权项

一种玉米醇溶蛋白基因RNAi载体pUC19‑RNAi‑22KD的构建方法，包括以下步骤：（1）构建含有胚乳特异性表达启动子P‑zp22/6的重组载体pUC19‑p22/6 ①胚乳特异性表达启动子P‑zp22/6的获得以玉米品种的基因组DNA为模板，以SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示序列为引物对，进行PCR扩增，得到如SEQ ID NO:3所示序列的胚乳特异性表达启动子P‑zp22/6；②构建含有胚乳特异性表达启动子P‑zp22/6序列的重组载体pUC19‑p22/6用SacⅠ和XbaⅠ酶切步骤（1）①得到的带有相应酶切位点的胚乳特异性表达启动子，然后与同样经SacⅠ和XbaⅠ酶切的骨架载体pUC19连接，得到带有胚乳特异性表达启动子P‑zp22/6的重组载体pUC19‑p22/6；（2）构建插入正向目的片段22‑KD‑P和胚乳特异性表达启动子P‑zp22/6的重组载体pUC19‑p22/6‑22KD1①22‑KD醇溶蛋白基因部分cDNA片段22‑KD‑P的获得以玉米籽粒总RNA为模板，以SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:5所示序列，进行RT‑PCR扩增，然后以此RT‑PCR产物为模板，以SEQ ID NO:6和SEQ ID NO:7所示序列为引物对，再进行RT‑PCR，得到如SEQ ID NO:8所示的22‑KD醇溶蛋白基因部分cDNA片段22‑KD‑P；②构建插入正向目的片段22‑KD‑P和胚乳特异性表达启动子P‑zp22/6的重组载体pUC19‑p22/6‑22KD1用SmaⅠ和XbaⅠ双酶切步骤（2）①得到的带有相应酶切位点的目的片段22‑KD‑P，然后与同样经SmaⅠ和XbaⅠ双酶切的步骤（1）②构建的重组载体pUC19‑p22/6连接，得到插入了正向目的基因22‑KD醇溶蛋白基因部分cDNA片段22‑KD‑P和胚乳特异性表达启动子P‑zp22/6的重组载体pUC19‑p22/6‑22KD1；（3）构建插入反向目的片段22‑KD‑P的重组载体pUC19‑22KD2用HindⅢ和XbaⅠ酶切步骤（2）①得到的带有相应酶切位点的目的片段22‑KD‑P，然后与同样经HindⅢ和XbaⅠ酶切的pUC19载体连接，得到插入反向目的基因22‑KD醇溶蛋白基因部分cDNA片段22‑KD‑P的重组载体pUC19‑22KD2；（4）构建含有终止子poly(A)的重组载体pUC19‑22KD2‑poly(A)以表达载体p3301 DNA为模板，用SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:10所示序列的终止子引物进行PCR扩增，得到如SEQ ID NO:11所示序列的终止子poly(A)；进一步用XhoⅠ和HindⅢ双酶切带有相应酶切位点的终止子poly(A)，然后与同样经XhoⅠ和HindⅢ双酶切的步骤（3）得到的重组载体pUC19‑22KD2连接，得到含有终止子poly(A)的重组载体pUC19‑22KD2‑poly(A)； （5）构建含有胚乳特异性表达启动子P‑zp22/6，正、反向目的片段22‑KD‑P和终止子poly(A)的重组载体pUC19‑p22/6‑22KD1‑22KD2‑poly(A)将步骤（2）构建的重组载体pUC19‑p22/6‑22KD1和步骤（4）构建的重组载体pUC19‑22KD2‑poly(A)分别用XbaⅠ和HindⅢ双酶切，然后将含有反向目的片段22‑KD‑P和终止子poly(A)的酶切产物22KD2‑poly(A)连接到步骤（2）构建的重组载体pUC19‑p22/6‑22KD1上，得到含有胚乳特异性表达启动子P‑zp22/6，正、反向目的基因22‑KD醇溶蛋白基因部分cDNA片段22‑KD‑P和终止子poly(A)的重组载体pUC19‑p22/6‑22KD1‑22KD2‑poly(A)； （6）GUS基因内含子的连接和玉米醇溶蛋白基因RNAi载体pUC19‑RNAi‑22KD的构建以质粒载体pGreen‑0229 Backbone DNA为模板，用SEQ ID NO:12和SEQ ID NO:13所示序列的GUS基因内含子引物进行PCR扩增，得到如SEQ ID NO:14所示序列的GUS基因内含子；进一步用XbaⅠ单酶切带有相应酶切位点的GUS基因内含子，然后与同样经XbaⅠ单酶切后磷酸化处理的步骤（5）构建的重组载体pUC19‑p22/6‑22KD1‑22KD2‑poly(A)连接，得到所述的玉米醇溶蛋白基因RNAi载体pUC19‑RNAi‑22KD，所述的玉米醇溶蛋白基因RNAi载体pUC19‑RNAi‑22KD的核苷酸序列如SEQ ID NO:15所示。