[发明专利]一种玉米醇溶蛋白基因RNAi载体的构建方法

权利要求书

1.一种玉米醇溶蛋白基因RNAi载体pUC19-RNAi-22KD的构建方法，包括以下步骤：

（1）构建含有胚乳特异性表达启动子P-zp22/6的重组载体pUC19-p22/6 

①胚乳特异性表达启动子P-zp22/6的获得

以玉米品种的基因组DNA为模板，以SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示序列为引物对，进行PCR扩增，得到如SEQ ID NO:3所示序列的胚乳特异性表达启动子P-zp22/6；

②构建含有胚乳特异性表达启动子P-zp22/6序列的重组载体pUC19-p22/6

用SacⅠ和XbaⅠ酶切步骤（1）①得到的带有相应酶切位点的胚乳特异性表达启动子，然后与同样经SacⅠ和XbaⅠ酶切的骨架载体pUC19连接，得到带有胚乳特异性表达启动子P-zp22/6的重组载体pUC19-p22/6；

（2）构建插入正向目的片段22-KD-P和胚乳特异性表达启动子P-zp22/6的重组载体pUC19-p22/6-22KD1

①22-KD醇溶蛋白基因部分cDNA片段22-KD-P的获得

以玉米籽粒总RNA为模板，以SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:5所示序列，进行RT-PCR扩增，然后以此RT-PCR产物为模板，以SEQ ID NO:6和SEQ ID NO:7所示序列为引物对，再进行RT-PCR，得到如SEQ ID NO:8所示的22-KD醇溶蛋白基因部分cDNA片段22-KD-P；

②构建插入正向目的片段22-KD-P和胚乳特异性表达启动子P-zp22/6的重组载体pUC19-p22/6-22KD1

用SmaⅠ和XbaⅠ双酶切步骤（2）①得到的带有相应酶切位点的目的片段22-KD-P，然后与同样经SmaⅠ和XbaⅠ双酶切的步骤（1）②构建的重组载体pUC19-p22/6连接，得到插入了正向目的基因22-KD醇溶蛋白基因部分cDNA片段22-KD-P和胚乳特异性表达启动子P-zp22/6的重组载体pUC19-p22/6-22KD1；

（3）构建插入反向目的片段22-KD-P的重组载体pUC19-22KD2

用HindⅢ和XbaⅠ酶切步骤（2）①得到的带有相应酶切位点的目的片段22-KD-P，然后与同样经HindⅢ和XbaⅠ酶切的pUC19载体连接，得到插入反向目的基因22-KD醇溶蛋白基因部分cDNA片段22-KD-P的重组载体pUC19-22KD2；

（4）构建含有终止子poly(A)的重组载体pUC19-22KD2-poly(A)

以表达载体p3301 DNA为模板，用SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:10所示序列的终止子引物进行PCR扩增，得到如SEQ ID NO:11所示序列的终止子poly(A)；进一步用XhoⅠ和HindⅢ双酶切带有相应酶切位点的终止子poly(A)，然后与同样经XhoⅠ和HindⅢ双酶切的步骤（3）得到的重组载体pUC19-22KD2连接，得到含有终止子poly(A)的重组载体pUC19-22KD2-poly(A)； 

（5）构建含有胚乳特异性表达启动子P-zp22/6，正、反向目的片段22-KD-P和终止子poly(A)的重组载体pUC19-p22/6-22KD1-22KD2-poly(A)

将步骤（2）构建的重组载体pUC19-p22/6-22KD1和步骤（4）构建的重组载体pUC19-22KD2-poly(A)分别用XbaⅠ和HindⅢ双酶切，然后将含有反向目的片段22-KD-P和终止子poly(A)的酶切产物22KD2-poly(A)连接到步骤（2）构建的重组载体pUC19-p22/6-22KD1上，得到含有胚乳特异性表达启动子P-zp22/6，正、反向目的基因22-KD醇溶蛋白基因部分cDNA片段22-KD-P和终止子poly(A)的重组载体pUC19-p22/6-22KD1-22KD2-poly(A)； 

（6）GUS基因内含子的连接和玉米醇溶蛋白基因RNAi载体pUC19-RNAi-22KD的构建

以质粒载体pGreen-0229 Backbone DNA为模板，用SEQ ID NO:12和SEQ ID NO:13所示序列的GUS基因内含子引物进行PCR扩增，得到如SEQ ID NO:14所示序列的GUS基因内含子；进一步用XbaⅠ单酶切带有相应酶切位点的GUS基因内含子，然后与同样经XbaⅠ单酶切后磷酸化处理的步骤（5）构建的重组载体pUC19-p22/6-22KD1-22KD2-poly(A)连接，得到所述的玉米醇溶蛋白基因RNAi载体pUC19-RNAi-22KD，所述的玉米醇溶蛋白基因RNAi载体pUC19-RNAi-22KD的核苷酸序列如SEQ ID NO:15所示。

2.一种玉米醇溶蛋白基因RNAi载体pUC19-RNAi-19KD的构建方法，包括以下步骤：

（1）构建含有胚乳特异性表达启动子P-zp22/6的重组载体pUC19-p22/6 

①胚乳特异性表达启动子P-zp22/6的获得

以玉米品种的基因组DNA为模板，以SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示序列为引物对，进行PCR扩增，得到如SEQ ID NO:3所示序列的胚乳特异性表达启动子P-zp22/6；

②构建含有胚乳特异性表达启动子zp22/6序列的重组载体pUC19-p22/6

用SacⅠ和XbaⅠ酶切步骤（1）①得到的带有相应酶切位点的胚乳特异性表达启动子，然后与同样经SacⅠ和XbaⅠ酶切的骨架载体pUC19连接，得到带有胚乳特异性表达启动子P-zp22/6的重组载体pUC19-p22/6；

（2）构建插入正向目的片段19-KD-P和胚乳特异性表达启动子P-zp22/6的重组载体pUC19-p22/6-19KD1

①19-KD醇溶蛋白基因部分cDNA片段19-KD-P的获得

以玉米籽粒总RNA为模板，以SEQ ID NO:16和SEQ ID NO:17所示的序列，进行RT-PCR扩增，然后以此RT-PCR产物为模板，以SEQ ID NO:18和SEQ ID NO:19所示序列为引物对，再进行RT-PCR，得到如SEQ ID NO:20所示序列的19-KD醇溶蛋白基因部分cDNA片段19-KD-P；

②构建插入正向目的片段19-KD-P和胚乳特异性表达启动子P-zp22/6的重组载体pUC19-p22/6-19KD1

用SmaⅠ和XbaⅠ双酶切步骤（2）①得到的带有相应酶切位点的目的片段19-KD-P，然后与同样经SmaⅠ和XbaⅠ双酶切的步骤（1）②构建的重组载体pUC19-p22/6连接，得到插入了正向目的基因19-KD醇溶蛋白基因部分cDNA片段19-KD-P和胚乳特异性表达启动子P-zp22/6的重组载体pUC19-p22/6-19KD1；

（3）构建插入反向目的片段19-KD-P的重组载体pUC19-19KD2

用HindⅢ和XbaⅠ酶切步骤（2）①得到的带有相应酶切位点的目的片段19-KD-P，然后与同样经HindⅢ和XbaⅠ酶切的pUC19载体连接，得到插入反向目的基因19-KD醇溶蛋白基因部分cDNA片段19-KD-P的重组载体pUC19-19KD2；

（4）构建含有终止子poly(A)的重组载体pUC19-19KD2-poly(A)

以表达载体p3301 DNA为模板，用SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:10所示序列的终止子引物进行PCR扩增，得到如SEQ ID NO:11所示序列的终止子poly(A)；进一步用XhoⅠ和HindⅢ双酶切带有相应酶切位点的终止子poly(A)，然后与同样经XhoⅠ和HindⅢ双酶切的步骤（3）得到的重组载体pUC19-19KD2连接，得到含有终止子poly(A)的重组载体pUC19-19KD2-poly(A)； 

（5）构建含有胚乳特异性表达启动子P-zp22/6，正、反向目的片段19-KD-P和终止子poly(A)的重组载体pUC19-p22/6-19KD1-19KD2-poly(A)

将步骤（2）构建的重组载体pUC19-p22/6-22KD1和步骤（4）构建的重组载体pUC19-19KD2-poly(A)分别用XbaⅠ和HindⅢ双酶切，然后将含有反向目的片段19-KD-P和终止子poly(A)的酶切产物19KD2-poly(A)连接到步骤（2）构建的重组载体pUC19-p22/6-19KD1上，得到含有胚乳特异性表达启动子P-zp22/6，正、反向目的基因19-KD醇溶蛋白基因部分cDNA片段19-KD-P和终止子poly(A)的重组载体pUC19-p22/6-19KD1-19KD2-poly(A)； 

（6）GUS基因内含子的连接和玉米醇溶蛋白基因RNAi载体pUC19-RNAi-19KD的构建

以质粒载体pGreen-0229 Backbone DNA为模板，用SEQ ID NO:12和SEQ ID NO:13所示序列的GUS基因内含子引物进行PCR扩增，得到如SEQ ID NO:14所示序列的GUS基因内含子；进一步用XbaⅠ单酶切带有相应酶切位点的GUS基因内含子，然后与同样经XbaⅠ单酶切后磷酸化处理的步骤（5）构建的重组载体pUC19-p22/6-19KD1-19KD2-poly(A)连接，得到所述的玉米醇溶蛋白基因RNAi载体pUC19-RNAi-19KD，所述的玉米醇溶蛋白基因RNAi载体pUC19-RNAi-19KD的核苷酸序列如SEQ ID NO:21所示。