[发明专利]一种玉米醇溶蛋白基因RNAi载体的构建方法

说明书

技术领域

本发明属于植物基因工程技术领域，特别涉及一种适合单子叶植物遗传转化的玉米醇溶蛋白基因RNAi载体的构建方法。 

背景技术

RNA干扰（RNA interference，RNAi）是指内源或外源双链RNA（double-stranded RNA,dsRNA）介导的内源靶基因的mRNA发生特异性降解，进而抑制基因的表达，产生相应的功能表型缺失的现象。RNAi技术目前已成为基因功能研究和作物品质改良的重要方法，其中靶基因RNAi载体的构建是其核心技术。为提高干扰效率，促进RNAi技术在植物遗传改良中的应用，国内外对RNAi载体的构建方法开展了较多研究。在植物RNA干扰表达载体构建中必需考虑的因素主要有两个方面：（1）方法简便、快捷、干扰效率高；（2）构建过程中对骨架载体和导入的目的片段限制较少。

目前，植物RNAi载体构建方法主要有三种，包括以酶切—连接为基础的RNAi载体传统构建方法，以同源重组为基础的植物RNA干扰表达载体构建方法如基于Gateway^TM技术的载体构建及以重组PCR技术为基础结合酶切—连接的植物RNA干扰载体构建方法。总体而言，传统RNAi载体构建方法耗时长，但技术比较成熟，适用范围广；基于Gateway^TM技术的RNAi载体构建方法是一种简便、快捷的选择，适于自动化、高通量的研究工作，但成本较高；如果骨架载体上缺乏所需酶切位点时，基于重组PCR技术的RNAi载体构建方法比较有效，但该技术较新，尚需进一步优化。在利用RNAi技术改良作物品质和植物遗传改良研究中，所构建的RNAi载体能否成功转化并达到改良的目的是RNAi技术尚需解决的另一技术问题。

玉米籽粒的蛋白质含量为10%左右，其中50-60％为人畜不能吸收利用的醇溶蛋白。国际玉米小麦改良中心（CIMMYT）在20世纪70年代开始利用隐性突变基因Opaque-2（o2）及其修饰基因将醇溶蛋白含量由55.1%降至22.9%，使赖氨酸含量水平达普通玉米的2倍，进而选育了大批高赖氨酸玉米即优质蛋白玉米并在全世界广泛应用（谭静等.优质蛋白玉米育种研究进展.玉米科学 2006, 14(5):15-19），但该方法转育周期长(7-10年)、效率低、预见性差，加之选育出的高赖氨酸玉米胚乳呈软质及抗病性差等问题，已越来越不适应现代育种目标的需要。优质蛋白玉米的营养价值相当于牛奶蛋白的90%，在全球许多以玉米为主食的国家和地区均可作为代用营养食品，因此对改善以玉米为主食的人群特别是学龄儿童的营养不良问题有重要意义。此外用优质蛋白玉米为主体的饲料养猪，比普通玉米饲料日增重30%以上，喂鸡可提高产蛋量15%以上。研究表明，由于醇溶蛋白特别是22-kD和19-kD醇溶蛋白基因的表达对赖氨酸含量有显著的负面效应，然而传统的育种方法难于找到理想的优质种质，获得赖氨酸含量高而醇溶蛋白低表达的玉米品种难度很大，主要原因在于其表型鉴定即赖氨酸含量测定需要使用高压液相色谱（HPLC）进行分析，由于HPLC运行成本很高，很难在大规模种质筛选及新品种选育过程中的大批量后代选择中广泛应用。因此，如果能通过RNA干扰技术，构建RNAi载体并转化获得赖氨酸含量高而醇溶蛋白低表达的转基因玉米，将是一种简便，快捷和有效的途径。

发明内容

本发明要解决的技术问题是克服现有技术（利用o2基因及其修饰基因转育获得醇溶蛋白含量低而赖氨酸含量高的玉米品种）转育周期长、效率低、预见性差，以及用现有技术选育出的高赖氨酸玉米品种由于o2基因的连锁效应导致其籽粒呈软质胚乳及抗病性差等缺陷和不足，其目的是提供两个玉米醇溶蛋白基因RNAi载体pUC19-RNAi-22KD和pUC19-RNAi-19KD的构建方法，实现抑制玉米醇溶蛋白的表达，提高赖氨酸的含量水平的目的。

本发明所提供的玉米醇溶蛋白基因RNAi载体pUC19-RNAi-22KD的构建方法，包括以下步骤：

（1）构建含有胚乳特异性表达启动子P-zp22/6的重组载体pUC19-p22/6 

①胚乳特异性表达启动子P-zp22/6的获得

以玉米品种的基因组DNA为模板，以SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示序列为引物对，进行PCR扩增，得到如SEQ ID NO:3所示序列的胚乳特异性表达启动子P-zp22/6；

②构建含有胚乳特异性表达启动子P-zp22/6序列的重组载体pUC19-p22/6