[发明专利]一种提取并测定茶树中谷胱甘肽过氧化物酶活性的方法

摘要

本发明属于酶检测领域，公开了一种提取并测定茶树中谷胱甘肽过氧化物酶活性的方法。该方法本发明以茶树叶片为提取材料，包含标准曲线制作，GSH-Px粗酶液提取，其中用含1mmol/L EDTA-2Na，4％的PPVP的pH6.2的0.2mol/L磷酸缓冲液进行提取，测得的GSH-Px活性最大；10％TCA配制时操作简单，沉淀效果较好；显色反应在6min时达最大值，且5-硫代-2-硝基苯阴离子在412nm处有最大吸光值。本实验方法具备材料容易获得、操作简单、容易控制、测定结果可靠的特点。

主权项

一种提取并测定茶树中谷胱甘肽过氧化物酶活性的方法，其特征在于包含如下步骤：(1)标准曲线的制作：配制一系列GSH浓度为0‑300μmol/L的GSH标准液，分别取各浓度的GSH标准液2.0ml，加0.32mol/L Na2HPO42.5ml、4mol/L NaOH 0.12ml和DTNB 0.5ml，显色6～7min，于412nm比色，同双蒸水调零，以OD值为纵坐标，GSH浓度为横坐标，制标准曲线，获得的标准曲线R2值都能达到0.999以上，且重复性较好；(2)GSH‑Px粗酶液提取：在pH6.2‑pH7.0的磷酸缓冲液中添加1mmol/L EDTA‑2Na，4％的PPVP作为酶提取液，提取茶树品种龙井43的叶片中的GSH‑Px，得到GSH‑Px粗酶液；(3)酶活力测定：取酶液各0.5ml，分别注于酶管和非酶管中，并将非酶管加热使酶失活，向酶管和非酶管中分别加入1.0mmol/L GSH 1.0ml和经37℃预热的1.5mmol/L H2O20.5ml，于37℃下反应3min，再向酶管和非酶管中分别加入10％TCA 3.0ml，12000r/min离心5min，保留上清液；另取2支试管分别加入上述酶管和非酶管的上清液2.0ml；再取1支试管加双蒸水0.8ml和10％TCA 1.2ml作为空白管，向这3支试管中各加入0.32mol/L Na2HPO42.5ml、4mol/L NaOH 0.12ml和DTNB 0.5ml反应6～7min，在412nm处比色读取OD值；将所得OD值带入代入下式，即可得到茶树中谷胱甘肽过氧化物酶的酶活力：GSH‑Px活力[U/(g·min)]＝[(OD非酶管‑OD酶管)×VT]/[A×W×t×VS]上式中，VT：提取液体积；A：标准曲线的斜率；W：叶片质量；t：反应时间；VS：酶液反应液体积；U：氧化GSH的量。