[发明专利]一种提取并测定茶树中谷胱甘肽过氧化物酶活性的方法

说明书

技术领域

本发明属于酶检测领域，涉及一种提取并测定茶树中谷胱甘肽过氧化物酶活性的方法。

背景技术

谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)与超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)是重要的抗氧化物酶。人们普遍认为谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)是哺乳动物体内的含硒酶，对动物中GSH-Px研究较多而对植物体中的GSH-Px研究甚少。同时随着世界环境的急剧变化，植物时常遭受着各种非生物胁迫，茶树也不例外。抗氧化酶是植物非生物胁迫中重要的防御系统，它们可通过降解的方法去除活性氧来抵抗非生物胁迫诱导产生的氧化伤害，从而减少对植物造成伤害。茶树中GSH-Px的提取和测定方法的确定，对于研究茶树非生物胁迫下抗氧化酶系统中各种酶的活性变化及彼此间的关系有重要意义。

虽然近年来已有人从部分植物中检测到该酶的活性，但对植物GSH-Px的提取和测定方法报道较少，在茶树上尚未有报道，且由于植物的种类不同，GSH-Px在其中的存在不同或存在形式不同，其检测体系会有很大不同。

经多次重复实验，发现《几种植物中谷胱甘肽过氧化物酶活性测定》中谷胱甘肽过氧化物酶的测定方法在测定茶树中谷胱甘肽过氧化物酶活性时无显色反应，同时发现实验过程中1.67％偏磷酸沉淀液配制相当麻烦、为剧毒试剂不利于实验人员的身体健康，同时其沉淀蛋白效果并不理想。本发明根据茶树的生理生化特性，以龙井43为材料，对GSH-Px的提取和测定方法进行了探索。

与《几种植物中谷胱甘肽过氧化物酶活性测定》中谷胱甘肽过氧化物酶测定方法相比，本发明在标准曲线绘制中调整了GSH的浓度、反应沉淀剂；根据茶树生理生化特性(富酚)，谷胱甘肽过氧化物酶提取时，于缓冲液中添加4％PVPP，避免提取过程中茶多酚对酶活性的影响；酶活性测定时，根据比较实验，筛选出合适的酶液用量、反应液用量、反应时间及测定波长。由于GSH-Px活性的测定是通过底物还原型谷胱甘肽(GSH)量的减少来间接反应酶活性。虽然GSH是GSH-Px高活性基质，GSH-Px对GSH作用生成氧化型谷胱甘肽(GSSG)具有高度特异性，但GSH本身就是抗氧化剂，也可被非特异地氧化成GSSG，即GSH在没有酶的条件下也能进行氧化还原反应，称非酶反应。本发明中以双蒸水代替酶液作为空白对照，非酶管加热使酶失活，同时测定酶管和非酶管的吸光度，以排除非酶反应的干扰。《几种植物中谷胱甘肽过氧化物酶活性测定》中采用蒸馏水做非酶反应对照管，此管只能扣除试剂的非酶反应，并不能扣除提取液中非酶反应。

发明内容

本发明的目的是针对现有技术的上述不足，提供一种提取并测定茶树中谷胱甘肽过氧化物酶活性的方法。

本发明的目的可通过如下技术方案实现：

一种提取并测定茶树中谷胱甘肽过氧化物酶活性的方法，包含如下步骤：

(1)标准曲线的制作：配制一系列GSH浓度为0-300μmol/L的GSH标准液，分别取各浓度的GSH标准液2.0ml，加0.32mol/L Na₂HPO₄2.5ml、4mol/L NaOH 0.12ml和DTNB 0.5ml，显色6～7min，于412nm比色，同双蒸水调零，以OD值为纵坐标，GSH浓度为横坐标，制标准曲线，获得的标准曲线R2值都能达到0.999以上，且重复性较好；

(2)GSH-Px粗酶液提取：在pH6.2～pH7.0的磷酸缓冲液中添加1mmol/L EDTA-2Na，4％的PPVP作为酶提取液，提取茶树品种龙井43的叶片中的GSH-Px，得到GSH-Px粗酶液；

(3)酶活力测定：取酶液各0.5ml，分别注于酶管和非酶管中，并将非酶管加热使酶失活，向酶管和非酶管中分别加入1.0mmol/L GSH 1.0ml和经37℃预热的1.5mmol/L H₂O₂0.5ml，于37℃下反应3min，再向酶管和非酶管中分别加入10％TCA3.0ml，12000r/min离心5min，保留上清液；另取2支试管分别加入上述酶管和非酶管的上清液2.0ml；再取1支试管加双蒸水0.8ml和10％TCA 1.2ml作为空白管，向这3支试管中各加入0.32mol/L Na₂HPO₄2.5ml、4mol/L NaOH 0.12ml和DTNB 0.5ml反应6～7min，在412nm处比色读取OD值；将所得OD值带入代入下式，即可得到茶树中谷胱甘肽过氧化物酶的酶活力：