[发明专利]一种提取并测定茶树中谷胱甘肽过氧化物酶活性的方法

权利要求书

1.一种提取并测定茶树中谷胱甘肽过氧化物酶活性的方法，其特征在于包含如下步骤：

(1)标准曲线的制作：配制一系列GSH浓度为0-300μmol/L的GSH标准液，分别取各浓度的GSH标准液2.0ml，加0.32mol/L Na₂HPO₄2.5ml、4mol/L NaOH 0.12ml和DTNB 0.5ml，显色6～7min，于412nm比色，同双蒸水调零，以OD值为纵坐标，GSH浓度为横坐标，制标准曲线，获得的标准曲线R²值都能达到0.999以上，且重复性较好；

(2)GSH-Px粗酶液提取：在pH6.2-pH7.0的磷酸缓冲液中添加1mmol/L EDTA-2Na，4％的PPVP作为酶提取液，提取茶树品种龙井43的叶片中的GSH-Px，得到GSH-Px粗酶液；

(3)酶活力测定：取酶液各0.5ml，分别注于酶管和非酶管中，并将非酶管加热使酶失活，向酶管和非酶管中分别加入1.0mmol/L GSH 1.0ml和经37℃预热的1.5mmol/L H₂O₂0.5ml，于37℃下反应3min，再向酶管和非酶管中分别加入10％TCA 3.0ml，12000r/min离心5min，保留上清液；另取2支试管分别加入上述酶管和非酶管的上清液2.0ml；再取1支试管加双蒸水0.8ml和10％TCA 1.2ml作为空白管，向这3支试管中各加入0.32mol/L Na₂HPO₄2.5ml、4mol/L NaOH 0.12ml和DTNB 0.5ml反应6～7min，在412nm处比色读取OD值；将所得OD值带入代入下式，即可得到茶树中谷胱甘肽过氧化物酶的酶活力：

GSH-Px活力[U/(g·min)]＝[(OD非酶管-OD酶管)×VT]/[A×W×t×VS]

上式中，VT：提取液体积；A：标准曲线的斜率；W：叶片质量；t：反应时间；VS：酶液反应液体积；U：氧化GSH的量。

2.根据权利要求1所述的提取并测定茶树中谷胱甘肽过氧化物酶活性的方法，其特征在于步骤(1)所述的一系列GSH浓度为0-300μmol/L的GSH标准液为GSH浓度为0μmol/L、20μmol/L、40μmol/L、60μmol/L、80μmol/L、100μmol/L、120μmol/L、180μmol/L、240μmol/L、300μmol/L的GSH标准液。

3.根据权利要求1所述的提取并测定茶树中谷胱甘肽过氧化物酶活性的方法，其特征在于步骤(2)所述的酶提取液为在pH6.2的磷酸缓冲液中添加1mmol/L EDTA-2Na，4％的PPVP。