[发明专利]利用RGP-3特异性分子标记快速鉴别11个烟草种质的方法

摘要

本发明公开了一种利用RGP-3特异性分子标记快速鉴别11个烟草种质的方法，所述的11个烟草种为K326、红花大金元、林烟草、粉蓝烟草、古特斯皮氏烟草、蓝茉莉烟草、匍匐烟草、黄花烟草、克利夫兰氏烟草、波叶烟草、花烟草，提取这11种烟草的基因组DNA，以其为模板，设计合成RGP-3引物，进行PCR扩增，以扩增产物经过测序后进行种质鉴别。本发明与现有技术相比：本发明具有能对烟草基因组DNA分子进行快速鉴别和检测的功能，为烟草抗逆育种研究提供科学、高效研究手段；当育成品种被非法使用和生产时，可利用该特异性引物进行准确鉴别，成为解决法律纠纷有力证据；有关这11个烟草种质来源的分子标记鉴别尚未见报道，这为烟草不同资源类型分子鉴别奠定基础。

主权项

1.一种利用RGP-3特异性分子标记快速鉴别11个烟草种质的方法，其特征是：所述的11个烟草种为K326、红花大金元、林烟草、粉蓝烟草、古特斯皮氏烟草、蓝茉莉烟草、匍匐烟草、黄花烟草、克利夫兰氏烟草、波叶烟草、花烟草，提取这11个烟草种的基因组DNA，以其为模板，设计合成RGP-3引物，进行PCR扩增，以扩增产物经过测序后进行种质鉴别，具体步骤为：A、基因组DNA获得：分别提取上述烟草种的基因组DNA；B、引物设计合成：以A步骤获得的基因组DNA为模板，经搜索GenBank数据库，根据林烟草的NsRGP-3序列（D67086），用Primer5.0软件，分别设计一对包含编码区在内的特异性引物，即正向引物F-primer具有5′TGTCAATTTATCTGCACAAATG3′的碱基序列和反向引物R-primer具有5′GCACGAAAAGAAGTCTTAATATA3′的碱基序列，然后完成引物的合成；C、基因组DNA的RGP-3基因序列PCR扩增：将A步骤提取的烟草基因组DNA作为模板DNA进行PCR扩增，所述的PCR反应体系为30μl，包括无菌水19.3μl、不含有MgCl₂的10×TaqDNA聚合酶缓冲液3.0μl、浓度为25mM的MgCl₂2.5μl、浓度为2.5mM的脱氧核糖核苷三磷酸dNTP2.0μl、浓度为5U/μl的TaqDNA聚合酶0.2μl、A步骤获得的模板DNA1.0μl和B步骤获得的浓度为10μM的F-primer和R-primer各1.0μl；PCR反应条件为在94℃下变性3分钟后，再进行在94℃下变性1分钟，在55℃下退火40秒，在72℃下延伸2分钟，经过35个循环，随后，在72℃下延伸5分钟，并放置在4℃下保存备用；D、特异性DNA片段获得、测序和差异比对：用电泳法对扩增出的特异性DNA片段在紫外观察仪下分别切取后，用QIAquickGelExtractionKit快速提取试剂盒回收纯化该DNA片段；将该片段分别用pGEM-T-EasyVectorSystems试剂盒进行克隆，通过蓝白斑平板筛选重组克隆菌落，并制备重组克隆质粒DNA，电泳检测其分子量大小，确定特异性DNA片段单拷贝插入的重组质粒后送去测序，将此步骤获得的11个烟草种的RGP-3基因组序列进行差异比对。