[发明专利]人抗凝血酶Ⅲ转基因羊的外源基因漂移风险的分析方法

摘要

人抗凝血酶III转基因羊的外源基因漂移风险的分析方法。包括如下步骤：引物及Taqman探针设计，血液基因组DNA的制备，ATIII基因的扩增，ATIII基因的克隆，荧光定量PCR检测和敏感性评价及定量分析。为了能够灵敏的检测到微量的ATIII基因，本研究建立了灵敏、特异的实时荧光定量PCR检测人ATIIII基因的技术方法，最低能检测到1copy的ATIII基因，并且检测特异性高。在此基础上，开展了抗凝血酶III转基因羊环境安全性评估的初步研究。完成了与ATIII转基因羊密切接触的同种和异种动物血液基因组中ATIII基因的检测工作(共57个样本)，结果表明人ATIII基因没有在转基因羊和非转基因羊及其它动物间发生漂移，提示转基因羊对于环境是安全的。

主权项

一种人抗凝血酶III转基因羊的外源基因漂移风险的分析方法，其特征是包括如下步骤：引物及Taqman探针设计，血液基因组DNA的制备，ATIII基因的扩增，ATIII基因的克隆，荧光定量PCR检测和敏感性评价及定量分析；其中，(1)引物及Taqman探针设计①利用Primer Primer 5.0软件分析人ATIII基因的序列NM_000488，设计并合成用于构建标准质粒的人ATIII特异性引物F5’‑gtgataggaactgtaacct‑3’；R：5’‑cggccagcaatcacaacag‑3’，②利用Applied Biosystems公司的Primer Express 3.0软件设计Taqman探针和引物F：5’‑TGTGATAGGAACTGTAACCTCTGG‑3’，R：5’‑GCTTGGCTGTGCAGATGTC‑3’，Taqman探针5’‑(FAM)TGTCCTTGCTGCTCATTGGCTTCTG(Eclipse)‑3’，③利用BLAST在线软件分析设计引物和探针序列的特异性；(2)血液基因组DNA的制备血样采用EDTA抗凝，血液置于1.5ml离心管中4℃保存备用；利用QIAGEN离心柱血液基因组提取试剂盒提取血液基因组；(3)ATIII基因的扩增①以编号A22的转ATIII基因羊血液基因组为模板；②PCR扩增体系如下：DNA模板10ng，10×Ex Taq bufer 2.5μl，dNTP 2.5mM 5μl，引物F 10pM，引物R 10pM，Taq酶0.2μl，ddH2O补到25μl。反应条件为94℃5min；95℃30S，55℃30S，72℃1.5min，25个循环；72℃10min；扩增片段大小为1263bp，以1％琼脂糖凝胶电泳分析扩增效果并回收；(4)ATIII基因的克隆利用DNA琼脂糖凝胶回收试剂盒将ATIII基因PCR扩增产物回收，胶回收产物连接到pMD18T载体中，转化E.coli DH5α，挑取单克隆，PCR鉴定，并测序鉴定；(5)质粒标准品浓度的计算将上述质粒用紫外分光光度计测定260nm与280nm波长下的OD值，判断其纯度，然后转换成质粒的拷贝数；(6)荧光定量PCR检测；(7)敏感性评价及定量分析；(8)特异性评价。