[发明专利]人抗凝血酶Ⅲ转基因羊的外源基因漂移风险的分析方法

说明书

技术领域

本发明属于对转基因动物环境安全的检测和评价领域，具体涉及一种人抗凝血酶III转基因羊的外源基因漂移风险的分析方法。 

背景技术

随着生物技术的快速发展，转基因动物研究的不断深入和加快，转基因育种成为培养新品种的重要途径，商业化转基因动物即将面世的同时，与转基因相伴而生的潜在的安全问题已引起世界各国的关注和重视^[1-2]。转基因动物是通过基因工程技术使生物遗传信息发生了转移、替换、融合和表达的遗传工程体，由于外源基因的插入，打破了原有的育种规律，改变了物种多样性局面，可能发生潜在的生物环境安全问题，造成重大经济损失，对人类生存造成威胁。因此，对转基因动物环境安全的检测和评价有利于保证人类健康和生态环境安全、促进转基因动物相关技术的快速健康发展。 

基因漂移是指转基因生物中转入的外来基因，转移到相邻的其他生物之中，从而改变其他生物的基因组成^[3]。转基因植物发生基因漂移可能引起的生态环境安全性问题已经引起广泛关注，而转基因动物发生基因漂移的可能性一直没有被重视。因而研究转基因动物发生基因漂移的可能性对于评价转基因动物环境安全性具有重要的意义。 

本研究建立了实时荧光定量PCR技术检测抗凝血酶III的技术方法，并充分发挥了申请人青岛森淼实业有限公司的转基因羊资源优势^[4]，开展抗凝血酶III(ATIII)转基因羊环境安全性评估的初步研究。 

发明内容

本发明采用如下技术方案实施： 

研究一种人抗凝血酶III转基因羊的外源基因漂移风险的分析方法，其特征是包括如下步骤：引物及Taqman探针设计，血液基因组DNA的制备，ATIII基因的扩增，ATIII基因的克隆，荧光定量PCR检测和敏感性评价及定量分析；其中， 

(1)引物及Taqman探针设计 

①利用Primer Primer 5.0软件分析人ATIII基因的序列NM_000488，设计并合成用于构建标准质粒的人ATIII特异性引物F5’-gtgataggaactgtaacct-3’；R：5’-cggccagcaatcacaacag-3’， 

②利用Applied Biosystems公司的Primer Express 3.0软件设计Taqman探针和引物 

F：5’-TGTGATAGGAACTGTAACCTCTGG-3’， 

R：5’-GCTTGGCTGTGCAGATGTC-3’， 

Taqman探针 

5’-(FAM)TGTCCTTGCTGCTCATTGGCTTCTG(Eclipse)-3’， 

③利用BLAST在线软件分析设计引物和探针序列的特异性； 

(2)血液基因组DNA的制备 

血样采用EDTA抗凝，血液置于1.5ml离心管中4℃保存备用；利用QIAGEN离心柱血液基因组提取试剂盒提取血液基因组； 

(3)ATIII基因的扩增 

①以编号A22的转ATIII基因羊血液基因组为模板； 

②PCR扩增体系如下： 

DNA模板10ng，10×Ex Taq bufer 2.5μl，dNTP 2.5mM  5μl，引物F  10pM  ，引物R 10pM  ，Taq酶0.2μl，ddH₂O补到25μl。反应条件为94℃5min；95℃30S，55℃30S，72℃1.5min，25个循环；72℃10min；扩增片段大小为1263bp，以1％琼脂糖凝胶电 泳分析扩增效果并回收； 

(4)ATIII基因的克隆 

利用DNA琼脂糖凝胶回收试剂盒将ATIII基因PCR扩增产物回收，胶回收产物连接到pMD18T载体中，转化E.coli DH5α，挑取单克隆，PCR鉴定，并测序鉴定； 

(5)质粒标准品浓度的计算 

将上述质粒用紫外分光光度计测定260nm与280nm波长下的OD值，计算DNA浓度并判断其纯度，然后转换成质粒的拷贝数； 

(6)荧光定量PCR检测； 

(7)敏感性评价及定量分析； 

(8)特异性评价 

上述的人抗凝血酶III转基因羊的外源基因漂移风险的分析方法，其特征是所述的与标准品对照计算每微升质粒拷贝数的方法是： 

①制备质粒标准品；标准品作10倍梯度稀释，-20℃保存备用；