[发明专利]高孵化率大口黑鲈亲本的分子标记筛选方法

摘要

高孵化率大口黑鲈亲本的分子标记筛选方法，涉及大口黑鲈的生产育种方法。利用大口黑鲈促生长激素释放激素（growth hormone releasing hormone,GHRH）基因启动子序列上一个66bp长度的隐性致死缺失突变位点侧冀序列，设计了一对引物，对待选择作亲本的大口黑鲈DNA样品进行PCR检测，扩增片段只有308bp一条带的是AA基因型个体，扩增片段有308bp和242bp两条带的是AB基因型个体。在生产中要去除AB基因型的亲本个体，保留AA基因型的亲本个体，以提高大口黑鲈的孵化率。本方法大约在5个小时内完成，为接下来的大口黑鲈苗种生产提供快速准确的检测结果，去除含有B缺失基因型的亲本个体，从根本上提高鱼的种质质量，提高大口黑鲈的孵化率。

主权项

高孵化率大口黑鲈亲本的分子标记筛选方法，其特征是：（一）引物的设计根据大口黑鲈促生长激素释放激素（growth hormone releasing hormone, GHRH）基因启动子序列上一个66bp长度的隐性致死缺失突变位点侧冀序列，设计并合成引物如下：P1：5’ CGGGCTGGTCTGTTAAATACAAGGT 3’，P2：5’ AACACAAGAGCACATTGCTTCCTC 3’；AA基因型个体预期扩增1条DNA带，大小308bp；AB基因型个体预期扩增2条DNA带，大小308bp和242 bp；（二）模板DNA的提取（1）取待检测亲鱼的鳍条组织3mg剪碎后，加入0.5mL的裂解液（10 mmol/L Tris HCl；0.1 mol/L EDTA；0.5% SDS；30mg/L RNase；100mg/L 蛋白酶K，pH8.0），55℃消化1小时，其间不时轻轻摇动；（2）加入等体积的酚/氯仿/异戊醇（25：24：1），颠倒混匀，室温下静置5分钟后，12000转/分钟离心10分钟，取上清液，再用氯仿抽提一次，室温下静置5分钟后，12000转/分钟离心10分钟，取上清液；（3）加入2倍体积的无水乙醇，室温静置10分钟沉淀DNA，12000转/分钟离心10分钟；（4）用70%乙醇洗涤1次，12000转/分钟离心2分钟，吸去上清，室温静置干燥10分钟，加入50μl TE（10mmol/L Tris－HCl；1mmol/L EDTA，pH8.0）溶解DNA，4℃贮存备用；（三）PCR反应体系ddH2O 20μL10×PCR Buffer 2.5μL4×dNTP（10mmol/L） 0.5μLTaq酶（5U/μL） 0.2μLP1 （10μmol/L） 0.4μLP2 （10μmol/L） 0.4μL模板DNA 1.0μL（四）PCR反应条件94℃预变性3分钟；94℃变性30秒，60℃退火30秒，72℃延伸30秒，32个循环；72℃延伸7分钟；（五）、琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增产物在1%的琼脂糖凝胶（含荧光染料）中电泳，电压5V/cM，电泳结束后在紫外灯下观察并照相。