[发明专利]高孵化率大口黑鲈亲本的分子标记筛选方法

权利要求书

1.高孵化率大口黑鲈亲本的分子标记筛选方法，其特征是：

（一）引物的设计

根据大口黑鲈促生长激素释放激素（growth hormone releasing hormone, GHRH）基因启动子序列上一个66bp长度的隐性致死缺失突变位点侧冀序列，设计并合成引物如下：

P1：5’- CGGGCTGGTCTGTTAAATACAAGGT -3’，

P2：5’- AACACAAGAGCACATTGCTTCCTC -3’；

AA基因型个体预期扩增1条DNA带，大小308bp；AB基因型个体预期扩增2条DNA带，大小308bp和242 bp；

（二）模板DNA的提取

（1）取待检测亲鱼的鳍条组织3mg剪碎后，加入0.5mL的裂解液（10 mmol/L Tris-HCl；0.1 mol/L EDTA；0.5% SDS；30mg/L RNase；100mg/L 蛋白酶K，pH8.0），55℃消化1小时，其间不时轻轻摇动；

（2）加入等体积的酚/氯仿/异戊醇（25：24：1），颠倒混匀，室温下静置5分钟后，12000转/分钟离心10分钟，取上清液，再用氯仿抽提一次，室温下静置5分钟后，12000转/分钟离心10分钟，取上清液；

（3）加入2倍体积的无水乙醇，室温静置10分钟沉淀DNA，12000转/分钟离心10分钟；

（4）用70%乙醇洗涤1次，12000转/分钟离心2分钟，吸去上清，室温静置干燥10分钟，加入50μl TE（10mmol/L Tris－HCl；1mmol/L EDTA，pH8.0）溶解DNA，4℃贮存备用；

（三）PCR反应体系

ddH₂O                                  20μL

10×PCR Buffer                     2.5μL

4×dNTP（10mmol/L）        0.5μL

Taq酶（5U/μL）                 0.2μL

P1 （10μmol/L）                0.4μL

P2 （10μmol/L）                0.4μL

模板DNA                             1.0μL

（四）PCR反应条件

94℃预变性3分钟；94℃变性30秒，60℃退火30秒，72℃延伸30秒，32个循环；72℃延伸7分钟；

（五）、琼脂糖凝胶电泳检测

PCR扩增产物在1%的琼脂糖凝胶（含荧光染料）中电泳，电压5V/cM，电泳结束后在紫外灯下观察并照相。