[发明专利]一种细菌Ⅰ型、Ⅱ型、Ⅲ型整合子基因的PCR检测方法

摘要

本发明公开了一种细菌I型、II型、III型整合子基因的PCR检测方法。由于本发明采用的引物来自细菌整合子基因中高度保守的整合酶区域，采用该引物对能准确、快速、方便的判别细菌是否含有整合子，并能区分是I型、II型、III型整合子，建立了一种多重PCR检测I型、II型、III型整合子的方法。通过实验证明该方法具有敏感性高、特异性好的特点，是一种快速准确检测I型、II型、III型整合子的方法。为筛选整合子类型及细菌耐药基因盒的分析，大规模的进行细菌耐药性的分子流行病学调查研究提供一种简便、快捷的方法。

主权项

一种细菌I型、II型、III型整合子基因的PCR检测方法，其特征在于该方法包括如下步骤：(1)PCR模板的制备：(1a)普通肉汤培养基摇瓶培养增菌；(2a)取5mL步骤(1a)得到的菌液，经普通肉汤培养基摇瓶培养3～6h后，置于无菌1.5mL离心管中，8000rpm离心3min，弃上清，再加入1mL无菌超纯水洗涤1～2次，重复离心一次，弃上清，加入500μL无菌超纯水重悬，沸水煮5min，5000rpm离心，取上清备用；(2)PCR扩增：细菌I型、II型、III型整合子基因的上下游引物序列如下：整合酶基因(int I)F：CCTCCCGCACGATGATCR：TCCACGCATCGTCAGGC整合酶基因(intII)F：TCATTAATGCGCAAACCTGCACCAR：ACGCACGGATATGCGACAAAAAGGT整合酶基因(intIII)F：CGGATGTCTGTGCCTGCTTGCR：CCACCGGCAGGCGCTCAAC25μL体系：2×PCRMasterMix 12.5μL；ddH2O 4.5μL；细菌I型、II型、III型整合子基因的上下游引物各1μL；模板2μL；PCR反应条件：94℃3min；然后94℃30s，57℃45s，72℃1min，30个循环；最后72℃延伸10min；4℃保存；(3)琼脂糖凝胶电泳：将0.3g琼脂糖和20mL 50×TAE置于锥形瓶中，完全溶解后加入核酸染料GoldView6.0μL，并倒入已放梳子的槽中，待其凝固后将PCR扩增产物取8μL点于已凝固的琼脂糖凝胶孔中，以5V/cm电压于TAE中电泳1h；(4)判断结果：紫外投射仪中观察结果，大小约280bp、380bp和650bp的条带，分别指示I型、II型、III型整合子基因。