[发明专利]一种细菌Ⅰ型、Ⅱ型、Ⅲ型整合子基因的PCR检测方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种细菌I型、II型、III型整合子基因的PCR检测方法，属于医学分子生物学领域。

背景技术

近年来由于抗生素的广泛应用，尤其是不合理的使用，细菌的耐药问题越来越严重，加上新抗生素的开发需要一个较长的周期，使得未来细菌感染的治疗陷入了一个两难的境地。整合子这一概念是1989年由Stokes H W等首次提出。整合子是一种基因单位，包括位点特异性重组功能的基因决定簇，在整合酶的作用下能捕获外来耐药基因。在整合子中可形成多种耐药基因的组合、排列。整合于整合子上的基因盒可借助整合子的强启动子而得以表达，是近年来发现的细菌耐药性传播的机制之一。

整合子是一种运动性的DNA分子，它的独特结构可捕获和整合外源性基因，并使之转变为功能性基因的表达单位，是通过转座子或接合性质粒将多种耐药基因在细菌中水平传播的一种遗传单位，定位于染色体和具有广泛宿主的质粒或转座子上。整合子存在于许多细菌中，在抗生素发现和应用前即已存在，是细菌的固有结构，并通过捕获外源性基因来增强细菌生存的适应性。在抗生素广泛应用条件下，整合子可捕获耐药基因，具有使耐药性在细菌之间传播的功能，是细菌竞争生存、适应环境的机制之一。

整合子根据其整合酶基因int序列的不同而分类的。整合酶属于酪氨酸整合酶家族，目前发现的整合酶至少有6类，I类～III类整合子的整合酶被命名为IntI～III，但Int 4后的命名有些混乱。

I类整合子在多药耐药的细菌中是最为常见的，它与Tn21转座子家族相关，其整合酶基因编码含有337个氨基酸的整合酶。其结构类似于缺陷型的转座子或转座子残基，5′CS有编码整合酶的基因intI及启动子Pant，部分还有启动子P2，3′CS包括3个开放阅读框(ORF)，即磺胺耐药基因(sulI)，季铵盐化合物及溴乙锭的耐受基因(qacEΔ1)，功能不明的ORF5。对于大多数I类整合子而言，5′CS均相似，而3′CS存在不同差异。现已在许多革兰氏阴性菌中分离出I类整合子，包括大肠埃希菌、沙门菌、铜绿假单胞菌、肺炎克雷伯菌、不动杆菌等[Fluit A C，Schmitz F J.Resistance integrons andsuperintegrons[J].Clin Microbiol Infect，2004，10(4)：272-288.]。

II类整合子以Tn7及其家族为代表，其整合酶基因int II被一个终止密码子中断，是缺陷的int基因，它的产物(整合酶)约有318个氨基酸，与int I的产物有46％的同源性，且3′保守末端包括5个tns基因，协助转座子移动。目前仅见几种基因，如核苷转移酶基因aadAla、甲氧苄啶耐药基因dhfr及链丝霉素耐药基因sat整合于该类整合子上。

III类整合子是近来由Arakawa在耐亚胺培南的黏质沙雷菌的耐药质粒上发现的，其整合酶int3有320个氨基酸，与int I有61％同源性。另外，还在肺炎克雷伯菌、假单胞菌、产碱杆菌等革兰阴性菌中分离出III类整合子。

20世纪90年代末，Mazel D等[Mazel D，Dychinco B，Webb V A，et al.A distinctive classof integron in the Vibrio cholerae genome[J].Science，1998，280：605-608.]在霍乱弧菌基因组中首次发现超级整合子(super integron，SI)。超级整合子结构远大于传统的整合子，能携带数百个基因盒，其整合酶亦有位点特异性重组活性。并有类似59be的结构——霍乱弧菌重复结构(vibrio cholera repetitive sequences，VCRs)，与59be不同的是VCRs具有高度序列保守性。I类整合酶能介导超整合子的基因盒在整合子中插入或切除，提示超级整合子可能是多重耐药整合子及其基因盒的祖先，并能长期指导宿主基因的进化，除霍乱弧菌外，在梅氏弧菌、费氏弧菌、拟态弧菌等[Rowe-Magnus D A，Guerout AM，Mazel D.Superintegrons[J].Res Microbiol，1999，150：641-651.]细菌的染色体基因组中也发现了超级整合子。