[发明专利]乳清蛋白抗氧化肽及其制备方法与它们的用途

摘要

本发明涉及一种乳清蛋白抗氧化肽及其制备方法与它们的用途。本发明利用干酪副产物乳清蛋白和酶制剂，通过酶法水解，制备得到乳清蛋白抗氧化肽酶解物，再将上述酶解物经大孔吸附静态或动态初步纯化、凝胶过滤色谱、制备型高效液相色谱和分析型高效液相色谱分离纯化后得到纯的乳清蛋白抗氧化肽产品，并测定多肽氨基酸序列，该产品具有良好的耐消化、耐热耐酸碱和耐储藏稳定性，较小分子量和特定氨基酸序列，能够有效清除自由基，阻断氧化反应，减少氧化损伤的产生，因此在食品、医药、饲料和化妆品领域中具有很广阔的应用前景。

主权项

一种乳清蛋白抗氧化肽的制备方法，其特征在于该方法的步骤如下：(i)酶解步骤：在酶反应器中制备浓度10‑50mg/mL乳清蛋白去离子水溶液，在温度45‑55℃下预处理10‑20min，然后用酸或碱将其pH调节到7.0‑10.5，再加入以乳清蛋白重量计1‑3重量%蛋白酶，在这个温度下进行酶解直到水解度达到18‑20%，同时用酸或碱保持该反应介质的pH恒定，然后在85‑100℃灭酶5‑10min，用碱或酸将其反应介质的pH调节到6.8‑7.2，再在8000‑10000r/min下冷冻离心10‑30min，得到含有10‑50mg/mL乳清蛋白抗氧化肽酶解物的上清液；(ii)初步纯化步骤：静态法，往步骤(i)得到的上清液中加入大孔吸附树脂，所述上清液与大孔吸附树脂的体积比是1:1‑2:1，在温度15‑30℃与150‑200r/min的条件下振荡12‑24h，然后分离上清液，该树脂再用50‑70体积%乙醇水溶液洗脱12‑24h；或动态法，使用尺寸φ2.6×30cm柱，让步骤(i)得到的含有乳清蛋白抗氧化肽酶解物的上清液以流速1‑2mL/min通过大孔吸附树脂柱，然后该树脂用去离子水以流速1‑2mL/min洗涤至电导率小于15μs/cm，再用65‑75体积%乙醇水溶液以流速0.5‑1mL/min进行洗脱；(iii)蒸发浓缩步骤：步骤(ii)得到的乙醇洗脱液在温度50‑65℃下进行旋转蒸发浓缩到100‑300mg/mL乳清蛋白抗氧化肽，再进行冷冻干燥，得到乳清蛋白抗氧化肽冻干物‑1；(iv)凝胶过滤色谱分离步骤：将步骤(iii)得到的乳清蛋白抗氧化肽冻干物‑1制备成10‑50mg/mL乳清蛋白抗氧化肽去离子水溶液，以流速为2‑3mL/min通过凝胶过滤色谱柱，再用去离子水以洗脱流速12‑24mL/h洗脱，得到的组分进行抗氧化活性测定，收集抗氧化活性最强的组分进行冷冻干燥，得到乳清蛋白抗氧化肽冻 干物‑2；(v)制备型高效液相色谱分离步骤：将步骤(iv)得到的乳清蛋白抗氧化肽冻干物‑2制备成10‑30mg/mL乳清蛋白抗氧化肽去离子水溶液，使用制备型反相高效液相色谱柱，以流速2‑3mL/min进行分离，得到的组分然后进行抗氧化活性测定，收集抗氧化活性最强的组分进行冷冻干燥，得到乳清蛋白抗氧化肽冻干物‑3；(vi)分析型高效液相色谱分离步骤：将步骤(v)得到的乳清蛋白抗氧化肽冻干物‑3制备成10‑20mg/mL乳清蛋白抗氧化肽去离子水溶液，以流速0.7‑1.5mL/min通过分析型高效液相色谱进行分离，得到的组分然后进行抗氧化活性的测定，收集抗氧化活性最强的组分进行冷冻干燥，得到乳清蛋白抗氧化肽冻干物‑4；(vii)液质联用分析多肽氨基酸序列：将步骤(vi)得到的乳清蛋白抗氧化肽冻干物‑4制备成5‑10mg/mL乳清蛋白抗氧化肽去离子水溶液，使用液相色谱串联四极杆飞行时间质谱仪分析氨基酸序列，得到母离子m/z 1568.70氨基酸序列为LDGNAKPTPEGDLEL，以及母离子m/z 1731.70氨基酸序列为LYEDLKPTPEGPMEL的两个抗氧化肽肽段。