[发明专利]一种筛选产多不饱和脂肪酸微生物的方法

摘要

本发明公开了一种快速筛选产多不饱和脂肪酸的方法，该方法以多不饱和脂肪酸合成的关键酶基因作为分子标记，基于PCR扩增技术快速定向筛选产多不饱和脂肪酸微生物，它根据已经报道的Δ6脂肪酸脱饱和酶(D6)和Δ5脂肪酸脱饱和酶基因(D5)的保守区设计引物，对从土壤或水体中分离得到的微生物依次进行扩增筛选，可以扩增出D6基因的微生物产GLA，可以同时扩增出D6和D5基因的产AA和EPA，然后对可以扩增出D6基因以及D6和D5基因的微生物进行发酵培养并提取脂肪酸，用GC和MS对微生物合成的脂肪酸进行分析，并最终确定产多不饱和脂肪酸的微生物。本发明为实现利用微生物发酵生产多不饱和脂肪酸提供了有效的菌种或藻种分离筛选方法及一批有效的出发菌株或藻种。

主权项

一种筛选产多不饱和脂肪酸微生物的方法，包括以下步骤：第1步从土壤或水体中分离、纯化保藏真菌或藻类微生物；第2步进行Δ6脂肪酸脱饱和酶(Delta6 Fatty Acid Desaturase，D6)基因片段的扩增检测：第2.1步将第1步分离、纯化得到的微生物每株接种到30～100mL的土豆葡萄糖PDA液体培养基或f/2培养基中，18℃～30℃、120～220rpm培养3～7天，收集微生物，再提取微生物基因组DNA，然后以该微生物基因组DNA为模板，按照下述要求进行D6基因片段的扩增检测：扩增检测使用的引物为简并引物，序列为：D6-F 5’-GGAAGG(A)AC(T)AAG(AT)CAC(T)AACA(G)C(T)T(G)CAC(T)CA -3’D6-R 5’-TGGTTCA(T或C)C(T或A)G(C)GGTGGA(T)TTGAACTA-3’；所述扩增检测中采用的PCR反应体系组成包括上述提取的微生物基因组DNA，25～200μM D6-F，25～200μM D6-R，50～200μM dNTPs，5μL10×PCR反应缓冲液，0.5～2.5units Taq DNA聚合酶，最后用灭菌ddH2O补足到50μL；所述扩增检测中PCR扩增条件为：93℃～96℃、2～6min；93℃～95℃、30sec～1min，50℃～60℃、30sec～1min，68℃～72℃、45sec～1min，共进行28～35个循环；之后，68℃～72℃再延伸6～10min；第2.2步扩增检测所得到的产物经琼脂糖凝胶电泳分析后，选择能够扩增出D6基因片段的微生物筛选组，继续进行分组筛选或对筛选组内的每个微生物进行D6基因片段的扩增检测；最终，通过琼脂糖凝胶电泳分析，收集所有能够扩增出D6基因片段的微生物，能够扩增到D6基因片段说明该微生物生产γ-亚麻酸(GLA)；第3步.将第2步中得到的含有D6基因片段的微生物筛选组或单个微生物按下述条件进行Δ5脂肪酸脱饱和酶(Delta5 Fatty Acid Desaturase，D5)基因片段的扩增检测：扩增检测D5基因片段使用的引物为简并引物，序列为：D5-F 5’-CAC(T)CACA(C)T(C)C(A)TAT(C)ACG(A或C)AAC(T)GT-3’D5-R 5’-GTG(T或C)A(G)C(T)C(G或T)CACCAC(T)CTG(C或T)TTCCC-3’D5基因片段的扩增检测所采用的反应体系为标准的PCR反应体系，包括含有D6基因的微生物的基因组DNA，30～150μM D5-F，30～100μM D5-R，50～200μM dNTPs，5μL 10×PCR反应缓冲液，1～2.5units Taq DNA聚合酶，最后用灭菌ddH2O补足到50μL；D5基因的扩增检测的PCR扩增条件为：93℃～96℃、2～6min；93℃～95℃、30sec～1min，50℃～55℃、45sec～1min，68℃～72℃、45sec～1.5min，共进行30～35个循环；之后，68℃～72℃再延伸6～9min；扩增产物经琼脂糖凝胶电泳分析，最终收集扩增有D5基因片段的单个微生物，得到产花生四烯酸(AA)和二十碳五烯酸(EPA)的微生物。