[发明专利]一种筛选产多不饱和脂肪酸微生物的方法

说明书

技术领域

本发明属于微生物生物技术和生物制药技术领域，具体涉及一种筛选 产多不饱和脂肪酸微生物的方法。

背景技术

多不饱和脂肪酸在机体内具有较广泛的生理功能和生物学效应，而且 双键愈多，不饱和程度愈高，营养价值也愈高。多不饱和脂肪酸具有维护 生物膜的结构和功能、治疗心血管疾病、抗炎、抗癌以及促进大脑发育、 减肥、增加动物的产仔率和成活率等生理功能。多不饱和脂肪酸通常来源 于高等植物、动物内脏和鱼油。但是，上述来源都存在产量不能满足市场 需求、价格昂贵的不足，利用微生物发酵生产多不饱和脂肪酸是解决这些 不足的一个有效方法。

利用微生物尤其是真菌或藻类生产多不饱和脂肪酸，首先要筛选产多 不饱和脂肪酸的微生物。筛选产油脂菌株的初筛方法有多种，如脂肪粒计 数法、苏丹III菌泥染色法、碳饥饿检出法等。碳饥饿检出法准确性较高，但 过于繁琐；脂肪粒计数法虽简便，但缺乏准确性，使用时必须同时考虑脂肪 粒的大小；苏丹III菌泥染色法虽然有较高的准确性，但需要显微镜观察， 操作仍显繁琐，如果对几十株、上百株甚至上千株微生物都进行检测、筛 选，将是一个十分耗时的工作。而且上述方法的一个共同缺点是不能定向 快速高通量筛选产多不饱和脂肪酸的微生物，使用这些方法筛选到的含油 脂菌株并不清楚是否含有所需要的目标多不饱和脂肪酸。

选育适于工业化生产的产脂菌株是一项十分艰巨和繁重的工作，因此， 必须建立一个能准确、高通量、快速地把产目标多不饱和脂肪酸的菌株从 所在的菌群中分离出来的初筛方法。

发明内容

本发明的目的在于提供一种筛选产多不饱和脂肪酸微生物的方法，该 方法具有筛选量大、速度快、筛选率高、可定向筛选的优点，有助于更好 地开发利用产多不饱和脂肪酸的微生物资源。

本发明提供的快速高通量筛选产多不饱和脂肪酸微生物的方法，包括 以下步骤：

一种筛选产多不饱和脂肪酸微生物的方法，包括以下步骤：

第1步从土壤或水体中分离、纯化保藏真菌或藻类微生物；

第2步进行Δ6脂肪酸脱饱和酶(Delta6 Fatty Acid Desaturase，D6) 基因片段的扩增检测：

第2.1步将第1步分离、纯化得到的微生物每株接种到30～100mL 的土豆葡萄糖PDA液体培养基或f/2培养基中，18℃～30℃、120～220rpm 培养3～7天，收集微生物，再提取微生物基因组DNA，然后以该微生物 基因组DNA为模板，按照下述要求进行D6基因片段的扩增检测：

扩增检测使用的引物为简并引物，  序列为：D6-F5’- GGAAGG(A)AC(T)AAG(AT)CAC(T)AACA(G)C(T)T(G)CAC(T)CA    -3’ D6-R5’-TGGTTCA(T或C)C(T或A)G(C)GGTGGA(T)TTGAACTA-3’；

所述扩增检测中采用的PCR反应体系组成包括上述提取的微生物基因 组DNA，25～200μM D6-F，25～200μM D6-R，50～200-dNTPs，5μL 10×PCR反应缓冲液，0.5～2.5 units Taq DNA聚合酶，最后用灭菌ddH₂O 补足到50μL；

所述扩增检测中PCR扩增条件为：93℃～96℃、2～6min；  93℃～ 95℃、30sec～1min，50℃～60℃、30sec～1min，68℃～72℃、45sec～ 1min，共进行28～35个循环；之后，68℃～72℃再延伸6～10min；

第2.2步扩增检测所得到的产物经琼脂糖凝胶电泳分析后，选择能够 扩增出D6基因片段的微生物筛选组，继续进行分组筛选或对筛选组内的每 个微生物进行D6基因片段的扩增检测；最终，通过琼脂糖凝胶电泳分析， 收集所有能够扩增出D6基因片段的微生物，能够扩增到D6基因片段说明 该微生物生产γ-亚麻酸(GLA)；

第3步.将第2步中得到的含有D6基因片段的微生物筛选组或单个微 生物按下述条件进行Δ5脂肪酸脱饱和酶(Delta5 Fatty Acid Desaturase，D5) 基因片段的扩增检测：