[发明专利]亚硝酸盐还原酶的制备方法及其酶制品

摘要

本发明公开了一种亚硝酸盐还原酶的制备方法，包括下列步骤：将乳酸菌接种于MRS培养基中，培养得第一代菌种，再培养得第二代菌种；将第二代菌种接到MRS发酵培养基，培养30-48h；将上述发酵液添加亚硝酸钠溶液，培养16-32h；收集沉淀；沉淀中加入缓冲液，将发酵液沉淀完全悬浮，再加入溶菌酶溶液和超声波处理得到破碎细胞液，收集上清液；上清液过滤，收集滤过液；将滤过液用葡聚糖凝胶层析柱分离，所得沉淀为亚硝酸盐还原酶，在所得沉淀中加入10-50％淀粉即得到所述酶制品。利用这种方法获得的酶制剂，可用于除去食品、饲料和环境中的亚硝酸盐残留，提高食品安全质量，以及预防亚硝酸盐引起的食物中毒和癌症等。

主权项

1.一种亚硝酸盐还原酶的制备方法，包括下列步骤：(1)将乳酸菌按2-5％接种量接种于MRS培养基中，在25-30℃条件下培养20-24h得第一代菌种，再将一代菌种以2-5％接种量接到MRS培养基，在25-30℃培养20-24h得第二代菌种；(2)将第二代菌种按照发酵培养基体积3％-8％接种量接到MRS发酵培养基，在25-30℃培养30-48h；(3)将上述发酵液用1mol/L的氢氧化钠调节pH值至6.2-6.4，按0.2--0.45mg/ml添加亚硝酸钠溶液。30℃培养16--32h；(4)将上述发酵液经4000-8000r/min，4-10℃，离心5-20min收集沉淀，向沉淀中加入4-5倍体积的pH6.5～7.5的磷酸盐缓冲液，待沉淀完全悬浮后在4-10℃、4000-8000r/min，离心5-20min，收集沉淀，并用相同方法重复两次再收集沉淀；(5)每50-100mg沉淀中加入1-5ml、pH6.5-7.5的磷酸盐缓冲液，将发酵液沉淀完全悬浮，再每100ml悬浮液加入2ml-5ml，0.05g/ml的溶菌酶溶液，35-50℃，80-100r/m，摇床中处理10-15h，再用超声波辅助破碎细胞，4-10℃，100-150W，5-10min，方式为工作2-5s，间歇2-5s，得到破碎细胞液，以3000-8000r/min，4-10℃离心5-30min，收集上清液；(6)上清液用0.22-0.45um的微孔滤膜过滤，收集滤过液；(7)将滤过液用葡聚糖凝胶层析柱分离，其中凝胶层析柱为G-75、G-100或G-150，用pH6.5-7.5磷酸盐缓冲液洗脱，收集具有亚硝酸盐还原酶活性的组分，将该组分装入透析袋，4-10℃用PEG-20000处理24h即得到亚硝酸盐还原酶。