[发明专利]甲型H1N1流感病毒与甲型流感病毒联合核酸实时荧光检测方法及试剂盒

摘要

本发明提供了一种同时检测甲型H1N1流感病毒及甲型流感病毒联合核酸实时荧光检测方法及试剂盒。本发明所述的甲型H1N1流感病毒与甲型流感病毒联合核酸实时荧光检测方法，包括以下步骤：1)病毒RNA的提取；2)荧光定量PCR检测；3)检测结果判断。通过序列多重比对，针对甲型流感病毒及甲型H1N1(2009年流行)流感病毒的保守基因片段，设计出特异性强的引物和探针，用于实时荧光RT-PCR检测。本发明可用于检测甲型人流感、猪流感、禽流感等流感病毒RNA，同时可以特异地检测甲型H1N1(2009年流行)流感病毒RNA，进行双重分析使检测结果更加可靠。

主权项

一种甲型H1N1流感病毒与甲型流感病毒联合核酸实时荧光检测方法，其特征在于，包括以下步骤：1)病毒RNA的提取：a)从已灭活的病毒培养液中取200‑400ul病毒样本加0.5ml Trizol，反复震荡，抽吸以利于病毒裂解，20‑37℃下孵化5分钟；b)在病毒裂解液中加入0.1ml的氯仿并震荡至乳糜化，20‑37℃下孵化10分钟，4℃12000rpm下离心15分钟，取上清液；c)在上清液中加入0.1ml的异丙醇，20‑37℃下孵化10分钟，4℃12000rpm下离心15分钟，去掉上清液，使沉淀干燥；d)加入0.5ml的75％乙醇洗涤沉淀，4℃7500rpm下离心5分钟，除尽上清液，使沉淀干燥，该沉淀为病毒样本的RNA；e)用焦碳酸二乙酯水20μl溶解RNA沉淀，RNA溶液于‑80℃下保存；2)荧光定量PCR检测：采用50μl的荧光定量PCR反应体系；甲型H1N1流感病毒检测体系包含：甲型H1N1流感病毒RT‑PCR反应液   29μl，酶混合液                       2μl，ROX校正液                      1μl，RNA提取液                      4μl；甲型流感病毒检测体系包含：甲型流感病毒RT‑PCR反应液       29μl，酶混合液                       2μl，ROX校正液                      1μl，RNA提取液                      4μl；实时荧光定量RT‑PCR反应程序：反转录   42℃5分钟，反转录酶灭活   95℃10秒，40个循环  95℃5秒，60℃31秒；所述的甲型H1N1流感病毒RT‑PCR反应液包含：RT‑PCR缓冲液；一对甲型H1N1流感病毒特异引物，上游引物的序列为SEQ ID NO.1，下游引物的序列为SEQ ID NO.2；以及一条甲型H1N1流感病毒TaqMan荧光探针，序列为SEQ ID NO.3，其中，5’端的荧光基团为6‑羧基荧光素，3’端的淬灭剂为6‑羧基四甲基若丹明；所述的甲型流感病毒RT‑PCR反应液包含：RT‑PCR缓冲液；一对甲型流感病毒特异引物，上游引物的序列为SEQ ID NO.4，下游引物的序列为SEQ ID NO.5；以及一条甲型流感病毒TaqMan荧光探针，序列为SEQ ID NO.6，其中，5’端的荧光基团为6‑羧基荧光素，3’端的淬灭剂为6‑羧基四甲基若丹明；所述的酶混合液，由Taq酶5U/μl和逆转录酶5U/μl以体积比1∶1混合组成；3)检测结果判断：荧光定量RT‑PCR程序结束后，仪器已自动记录保存每个循环的荧光信号，进行阈值调整后，通过检测甲型H1N1和甲型流感病毒的扩增曲线及Ct值进行结果判断。