[发明专利]甲型H1N1流感病毒与甲型流感病毒联合核酸实时荧光检测方法及试剂盒

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及一种同时检测甲型及甲型H1N1流感病毒的实时荧光检测方法及试剂盒。

背景技术

流行性感冒简称流感，是由甲型、乙型、丙型三种流感病毒引起的急性呼吸道传染病。根据其表面结构(血凝素H和神经氨酸酶N)及其基因特性的不同，甲型流感病毒又可分成许多亚型，至今甲型流感病毒已发现的血凝素有16个亚型(H1-H16)，神经氨酸酶9个亚型(N1-N9)。甲型H1N1流感病毒是其中的一种亚型，它引起甲型H1N1流感。

2009年从墨西哥爆发并蔓延到全球多个国家的人感染甲型H1N1流感疫情，是由于一种新变异的甲型H1N1流感病毒引发的，被世界卫生组织称为“国际关注的突发公共卫生事件”，已达到了最高的6级警告标准。

引起本次甲型H1N1流感的流感病毒的毒株包含有猪流感、禽流感和人流感等三种流感病毒的基因片段(余健民.甲型H1N1流感的诊治与预防.江西医药，2009，44(4))。本次甲型H1N1流感具有以下几个特点：一是此次疫情由新的流感病毒变异株引起，人群普遍易感，已引起跨国、跨洲传播。二是出现了人传人病例。三是墨西哥已经出现了较多的重症和死亡病例。四是流感病人在发病前一天已可排毒，有些人感染后不发病，但仍然具有传染性，隐性传染比例相当高。

今年流行的甲型H1N1病毒已经蔓延到世界许多国家，不足一个月，全球确诊的甲型H1N1流感病例已突破万例，我国也出现了多例输入性流感病例。给人类生命安全造成了一定危害，包括我国政府在内的世界各国都采取了积极有效的防控措施，以防止疾病的迅速蔓延。面对突然爆发的流行性疾病，开展对疾病预防、诊断、致病机理以及治疗研究是相关领域关注和研究的重点。

荧光定量PCR具有灵敏、准确、实时的技术优点，通过针对当前流行的甲型H1N1和甲型流感病毒，设计不同的引物和探针，组装成荧光定量PCR试剂盒，迅速准确检测甲型流感病毒及当前流行的甲型H1N1流感病毒，以便开展早期大规模筛查及有效地控制疾病的迅速传播。

发明内容

本发明的目的在于提供了一种甲型H1N1流感病毒与甲型流感病毒联合核酸实时荧光检测方法以及相应的试剂盒，采用两种探针同时检测甲型H1N1流感病毒(2009年流行的新变种)和甲型流感病毒，通过双重验证使结果更加稳定；同时也可以区分甲型流感病毒及其他病毒，以及区分甲型H1N1流感病毒(2009年流行的新变种)及其他普通流感病毒。

本发明所述的一种甲型H1N1流感病毒与甲型流感病毒联合核酸实时荧光检测方法，包括以下步骤：

1)病毒RNA的提取：

a)从已灭活的病毒培养液中取200-400ul病毒样本加入0.5ml Trizol，反复震荡，抽吸以利于病毒裂解，20-37℃下孵化5分钟；

b)在病毒裂解液中加入0.1ml的氯仿并震荡至乳糜化，20-37℃下孵化10分钟，4℃12000rpm下离心15分钟，取上清液；

c)在上清液中加入0.1ml的异丙醇，20-37℃下孵化10分钟，4℃12000rpm下离心15分钟，去掉上清液，使沉淀干燥；

d)加入0.5ml的75％乙醇洗涤沉淀，4℃7500rpm下离心5分钟，除尽上清液，使沉淀干燥，该沉淀为病毒样本的RNA；

e)用焦碳酸二乙酯水20μl溶解RNA沉淀，RNA溶液于-80℃下保存；

2)荧光定量PCR检测：

采用50μl的荧光定量PCR反应体系；

甲型H1N1流感病毒检测体系包含：

甲型H1N1流感病毒RT-PCR反应液        29μl，

酶混合液                            2μl，

ROX校正液                           1μl，

RNA提取液                        4μl；

甲型流感病毒检测体系包含：

甲型流感病毒RT-PCR反应液         29μl，

酶混合液                         2μl，

ROX校正液                        1μl，

RNA提取液                        4μl；

实时荧光定量RT-PCR反应程序：

反转录  42℃5分钟，

反转录酶灭活  95℃10秒，

40个循环  95℃5秒，60℃31秒；