[发明专利]甲型H1N1流感病毒与甲型流感病毒联合核酸实时荧光检测方法及试剂盒

权利要求书

1.一种甲型H1N1流感病毒与甲型流感病毒联合核酸实时荧光检测方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)病毒RNA的提取：

a)从已灭活的病毒培养液中取200-400ul病毒样本加0.5ml Trizol，反复震荡，抽吸以利于病毒裂解，20-37℃下孵化5分钟；

b)在病毒裂解液中加入0.1ml的氯仿并震荡至乳糜化，20-37℃下孵化10分钟，4℃12000rpm下离心15分钟，取上清液；

c)在上清液中加入0.1ml的异丙醇，20-37℃下孵化10分钟，4℃12000rpm下离心15分钟，去掉上清液，使沉淀干燥；

d)加入0.5ml的75％乙醇洗涤沉淀，4℃7500rpm下离心5分钟，除尽上清液，使沉淀干燥，该沉淀为病毒样本的RNA；

e)用焦碳酸二乙酯水20μl溶解RNA沉淀，RNA溶液于-80℃下保存；

2)荧光定量PCR检测：

采用50μl的荧光定量PCR反应体系；

甲型H1N1流感病毒检测体系包含：

甲型H1N1流感病毒RT-PCR反应液   29μl，

酶混合液                       2μl，

ROX校正液                      1μl，

RNA提取液                      4μl；

甲型流感病毒检测体系包含：

甲型流感病毒RT-PCR反应液       29μl，

酶混合液                       2μl，

ROX校正液                      1μl，

RNA提取液                      4μl；

实时荧光定量RT-PCR反应程序：

反转录   42℃5分钟，

反转录酶灭活   95℃10秒，

40个循环  95℃5秒，60℃31秒；

所述的甲型H1N1流感病毒RT-PCR反应液包含：

RT-PCR缓冲液；

一对甲型H1N1流感病毒特异引物，上游引物的序列为SEQ ID NO.1，下游引物的序列为SEQ ID NO.2；以及

一条甲型H1N1流感病毒TaqMan荧光探针，序列为SEQ ID NO.3，其中，5’端的荧光基团为6-羧基荧光素，3’端的淬灭剂为6-羧基四甲基若丹明；

所述的甲型流感病毒RT-PCR反应液包含：

RT-PCR缓冲液；

一对甲型流感病毒特异引物，上游引物的序列为SEQ ID NO.4，下游引物的序列为SEQ ID NO.5；以及

一条甲型流感病毒TaqMan荧光探针，序列为SEQ ID NO.6，其中，5’端的荧光基团为6-羧基荧光素，3’端的淬灭剂为6-羧基四甲基若丹明；

所述的酶混合液，由Taq酶5U/μl和逆转录酶5U/μl以体积比1∶1混合组成；

3)检测结果判断：

荧光定量RT-PCR程序结束后，仪器已自动记录保存每个循环的荧光信号，进行阈值调整后，通过检测甲型H1N1和甲型流感病毒的扩增曲线及Ct值进行结果判断。

2.一种甲型流感病毒与甲型H1N1流感病毒联合核酸实时荧光检测的试剂盒，包括ROX校正液、焦碳酸二乙酯水、阴性对照、甲型阳性对照、甲型H1N1阳性对照，其特征在于，还包括以下成分：

甲型H1N1流感病毒RT-PCR反应液，包含：

RT-PCR缓冲液；

一对甲型H1N1流感病毒特异引物，上游引物的序列为SEQ ID NO.1，下游引物的序列为SEQ ID NO.2；以及

一条甲型H1N1流感病毒TaqMan荧光探针，序列为SEQ ID NO.3，其中，5’端的荧光基团为6-羧基荧光素，3’端的淬灭剂为6-羧基四甲基若丹明；

以及

甲型流感病毒RT-PCR反应液，包含：

RT-PCR缓冲液；

一对甲型流感病毒特异引物，上游引物的序列为SEQ ID NO.4，下游引物的序列为SEQ ID NO.5；以及

一条甲型流感病毒TaqMan荧光探针，序列为SEQ ID NO.6，其中，5’端的荧光基团为6-羧基荧光素，3’端的淬灭剂为6-羧基四甲基若丹明；

以及

酶混合液，由Taq酶5U/μl和逆转录酶5U/μl以体积比1∶1混合组成。